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《熒光實(shí)時定量PCR 技術(shù)初探》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、生命科學(xué)趨勢2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences熒光實(shí)時定量PCR技術(shù)初探張鋆（責(zé)任編輯：xmale）摘要：少量的DNA序列的準(zhǔn)確定量曾經(jīng)是一件很難很累的事情，不過realtimePCR的出現(xiàn)把它變?yōu)楹推胀≒CR差不多一樣容易。原理是利用能特異標(biāo)記PCR產(chǎn)物的熒光物質(zhì)，顯示PCR產(chǎn)物的動態(tài)累積，得到S型的擴(kuò)增曲線；假設(shè)該曲線的前期PCR符合指數(shù)性擴(kuò)增，于是在單純指數(shù)方程的基礎(chǔ)上，通過比較產(chǎn)物積累的速度（時間）來間接比較（進(jìn)而確定）初始模板的分子數(shù)。我們試驗(yàn)了標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，以及
2、對免疫相關(guān)的目的基因IL-4轉(zhuǎn)錄水平的定量，而且用HPRT持家基因?qū)L-4進(jìn)行歸一化。結(jié)果與RT-PCR相近。靈敏度，誤差降低，可重復(fù)性有望更上一層樓。關(guān)鍵詞：realtimePCR定量熒光SYBR擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線cDNAAbstract:IthadbeendifficultandtiringtoquantitateasmallamountofDNAuntiltheinventionofrealtimePCRtechnique,whichisaseasyasregularPCR.Itproducesandd
3、isplaysthekineticaccumulationofPCRproduct(oramplicon)----calledamplificationcurve.Assumingthatampliconsareamplifiedxexponentiallyduringtheearliercycles,wemakeuseofthesimpleequationy=atocomparethestartcopynumberofageneindifferentsamples,bymeasuringthethresho
4、ldcycle(Ct).Andwithsomestandard,copynumberofagenecanbequantified.Inthisexperimentwetriedmakingsomestandardcurves.ThenwequantifiedIL-4cDNAin3subsetsofThelpercell,normalizedbyHPRThousekeepinggene.TheresultcorrelateswithRT-PCR.However,sensitivity,deviationandp
5、recisionstillneedtobeimproved.Keyword:realtimePCRquantitationfluorescenceSYBRGreenIamplificationcurvestandardcurvecDNA收稿日期：2003-10-10；接受日期：2003-10-15作者簡介：張鋆，生物技術(shù)專家。1生命科學(xué)趨勢2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences1前言1.1發(fā)明熒光實(shí)時定量PCR，由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems）在199
6、6年發(fā)明。除了realtime(quantitative)PCR，有人也稱它為kineticPCR。顧名思義，它不單指數(shù)性擴(kuò)增（已知部分序列的目的）DNA，而且通過檢測每個循環(huán)PCR產(chǎn)物的總累積量（借助熒光標(biāo)志），可以達(dá)到很好的定量結(jié)果。圖1：ABIGeneAmp5700全套設(shè)備。組成：熱循環(huán)儀，熒光檢測器，電腦。1.2原理（1）PCR：Polymerasechainreaction.是體外模擬生物的DNA復(fù)制。需要DNA聚合酶，DNA模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs(dATP,ACTP,dGTP,dTT
7、P),以及適當(dāng)?shù)木彌_體系。NPCR產(chǎn)物的增長形式為２(如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N是循環(huán)數(shù))。實(shí)際中，擴(kuò)增效率不為100％。RealtimePCR是定量PCR的一種，當(dāng)然是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的。（普通）PCR包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環(huán)數(shù)，程序，PCR產(chǎn)物（擴(kuò)增子，amplicon）的量，擴(kuò)增曲線（擴(kuò)增子累積曲線），摻錯率，擴(kuò)增子長度。一般來說，人們關(guān)心的是擴(kuò)增子的量。而realtimePCR主要利用的是擴(kuò)增曲線（amplificationcurve）,循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增子長度，擴(kuò)增效率
8、，擴(kuò)增子多少，也加以考慮。普通PCR是在擴(kuò)增完以后，（無論多少個循環(huán)），進(jìn)行電泳，染色。對于判斷目的DNA有沒有，是出色的。但對于檢測目的DNA有多少分子（初始的時候），則勉為其難。因?yàn)镻CR的理想和實(shí)際仍相差一段距離。理論界普遍認(rèn)為，PCR的起始若干循環(huán)內(nèi)，由于原料，酶的充足，抑制子（抑制PCR的因素，如2生命科學(xué)趨勢2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciencesdNTPs分
