實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用.doc

實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用.doc

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1、實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(圖)一、實時熒光定量PCR原理(一)定義:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。(二)實時原理1、常規(guī)PCR技術(shù):對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量,無法對擴增反應(yīng)實時檢測。2、實時定量PCR技術(shù):利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析3、如何對起始模板定量??通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進

2、行定量分析.4、幾個概念:(1)擴增曲線:(2)熒光閾值:(3)Ct值:?????CT值的重現(xiàn)性:5、定量原理:理想的PCR反應(yīng):??X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng):?X=X0(1+Ex)n?????n:擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)?????X:第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量?????X0:初始模板量?????Ex:擴增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線6、絕對定量1)確定未知樣品的C(t)值2)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的熒光標(biāo)記:二、實時熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一:SYBRGreen法(一)工作原理1、SYB

3、RGreen?能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位?????2、SYBRGreen?只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時,DNA雙鏈分開,無熒光4、復(fù)性和延伸時,形成雙鏈DNA,SYBRGreen發(fā)熒光,在此階段采集熒光信號。PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:?1、SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性,太低,熒光信號太弱,不易檢測?  2、Primer:引物的特異性高,否則擴增有雜帶,定量不準(zhǔn)?  3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物  4、反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化  5、反應(yīng)溫度和時間

4、參數(shù):由酶和引物決定  ?6、其他與常規(guī)PCR相同(二)應(yīng)用范圍1、起始模板的測定;  2、基因型的分析;  3、融解曲線分析:可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件,對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義,如對primer的評價;可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。(三)優(yōu)點及缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性;適用于任何DNA;使用方便;不必設(shè)計復(fù)雜探針;非常靈敏;便宜。?缺點:容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合,產(chǎn)生假陽性;但可以通過融解曲線的分析,優(yōu)化反應(yīng)條件;??對引物特異性要求較高。方法二:TaqMan---水解型雜交探針?**

5、5′端標(biāo)記有報告基團(Reporter,R)?,如FAM、VIC等?  **3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)  **探針完整,R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收,無熒光,R與Q分開,發(fā)熒光  **Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探針(一)工作原理注意:每擴增一條DNA分子,釋放一個熒光信號,可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光PCR反應(yīng)的建立:1、引物、探針的設(shè)計:?探針Tm為68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能會淬滅熒光素,  引物盡量靠近探針,擴增片段<400bp,引物Tm為59-60℃

6、2、反應(yīng)參數(shù)的確定:一般為:94℃,10-20S  ?60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高)  ?也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃,45S,3、優(yōu)化引物和探針濃度:獲得最小Ct值,信號/背景比值的最大值?  引物濃度:50-900nM  ?探針濃度:50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同(二)優(yōu)缺點優(yōu)點:  對目標(biāo)序列的高特異性??????  ?------陰性結(jié)果確定  設(shè)計相對簡單??????  ------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補  重復(fù)性比較好缺點:  只適合一個特定的目標(biāo); 

7、 委托公司標(biāo)記,價格較高;  不易找到本底低的探針

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