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《實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用RealtimeQuantitativePCR》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)講座提綱實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)原理常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)定
2、量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對(duì)起始模板定量？通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-----------擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾值（threshold）：前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（basel
3、ine），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)域值實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；
4、Ct值則極具重現(xiàn)性實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+lo
5、gM(3)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量確定未知樣品的C(t)值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理絕對(duì)定量25講座提綱實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量P
6、CR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記QQR實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreenSYBRGreen法工作機(jī)理SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)
7、熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)
8、雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCy
