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《β-葡萄糖苷酶的分離純化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、本章以裂褶菌DS1液體發(fā)酵粗酶液為研究對象，對粗酶液中β-葡萄糖苷酶先后進行硫酸銨沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow陰離子層析、Sephacry1S-200分子篩層析等方法對其進行分離純化，并在此基礎(chǔ)上對該酶的一般性質(zhì)進行研究。4.1材料與方法4.1.1材料4.1.1.1菌種:裂褶菌（S.commune）DS1，由華中科技大學生命科學與技術(shù)學院資源與環(huán)境微生物所提供4.1.1.2培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯(200g)，蔗糖(20g)，瓊脂(30g)，水（1000mL）種子培養(yǎng)基(PDY培養(yǎng)基)：馬鈴薯(200g)，蔗
2、糖(20g)，水（1000mL）發(fā)酵培養(yǎng)基：纖維素(3.2g),蛋白胨(3.0g),KH2PO4(0.2g),Ca(NO3)2.4H2O(1.5g),MgSO4.7H2O(0.5g),水(100mL)4.1.1.3緩沖溶液0.2mol/LpH=8.10Tris-HCL緩沖溶液：稱取6.055gTris溶于500mL雙蒸水中；量取4.2mL鹽酸溶液溶于500mL雙蒸水中；將262mL鹽酸溶液和500mL雙蒸水（含Tris）混合即成0.2molpH=8.10Tris-HCl緩沖溶液。4.1.1.4試劑:對硝基酚-β-葡萄糖苷（pNPG）Sigma公司對
3、硝基酚（NPG）Sigma公司DEAE-SepharoseFastFlowAmersham公司Sephacry1S-200Amersham公司蛋白胨北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司硫酸銨上海實驗試劑有限公司過硫酸按Fluka公司考馬斯亮藍R-250，G-250北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心丙烯酞胺、甲叉雙丙烯酞胺中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司TEMEDSigma公司PMSFSigma公司SDSSigma公司Tris上海伯奧生物科技有限公司甘氨酸Sigma公司甲硫氨酸上海伯奧生物科技有限公司低分子量標準蛋白天根生化科技（北京）有限公司PEG-20000天津
4、市科密歐實驗化學試劑開發(fā)中心快速銀染試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所蘆?。ā?5％）國藥集團化學試劑有限公司槐角苷（90％）實驗室自制槐角提取物（10：1）西安天園生物技術(shù)有限公司4.1.1.4儀器TG-332A微量分析天平上海天平儀器廠低速大容量離心機上海精密儀器儀表有限公司電泳儀(DYY-Ш型)北京六一儀器廠UV2000紫外-可見光分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司4.1.2方法4.1.2.1粗酶液的獲得方法將菌種DS1接種到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌塊接入PDY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d制備一級液體種，再以10％的接種量接入PDY培養(yǎng)基中培養(yǎng)
5、3d制備二級液體種。按10%的接種量將二級種加入含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于27℃，150r/min搖床上培養(yǎng)。每天取一瓶發(fā)酵液在4000r/min條件下離心10min后，取上清液在標準條件下用pNPG測定β-葡萄糖苷酶的活性。如此持續(xù)取三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)液直至培養(yǎng)的第10d為止，取β-葡萄糖苷酶的活性最高的培養(yǎng)液為粗酶液。4.1.2.3對硝基酚標準曲線的繪制見方法2.1.2.2。4.1.2.4β-葡萄糖苷酶酶活測定對硝基酚-β-葡萄糖苷（pNPG）法[54]測定β-葡萄糖苷酶酶活。4.1.2.5蛋白質(zhì)含量的測定考馬斯亮藍G250法。將測試酶液稀釋到
6、一定濃度，取0.5mL于試管中再加入2.5mL考馬斯亮藍G250試劑，搖勻，靜置10min后，在595nm條件下進行蛋白質(zhì)含量測定。以牛血清蛋白做標準曲線為Y=4.905X-0.0131，R2=0.9928(Y為吸光值，X蛋白質(zhì)含量)。4.1.2.6硫酸銨分級沉淀、脫鹽和濃縮1.確定鹽析時飽和度范圍（1）取粗酶液7份，每份15mL;（2）分別用飽和度為20％-80%相對飽和度的(NH4)2SO4于4℃鹽析12h;（3）以不加硫酸銨的酶液為對照，于冰箱中于4℃鹽析12h；（4）8500r/min于4℃離心20min;（5）分別收集各離心管中的上清液和
7、沉淀，并用pH5.0的乙酸-乙酸鈉恢復(fù)至原體積，在A595與A410條件下分別測定其蛋白質(zhì)含量和β-葡萄糖苷酶活力。2.最佳pH條件下鹽析（1）在100ml粗酶液中緩慢加入硫酸銨至X1%飽和度；（2）4℃靜置12h;（3）4℃，8500r/min條件下離心20min，取上清液，測量上清液體積；（4）在上清液中繼續(xù)緩慢加硫酸銨至X2%飽和度；（5）4℃靜置12h;（6）4℃,8500r/min條件下離心20min，取上清液，沉淀溶于最佳pH值的乙酸-乙酸鈉中。并在相同的緩沖溶液中透析過夜，直至檢測不出SO42+為止,4500r/min離心15min，
8、取上清。4.1.2.7DEAE-SepharoseF.F.陰離子交換柱層析將收集的上清液施于經(jīng)Tris-HCL緩沖液(pH
