分離方法對移植卵巢卵泡發(fā)育的影響

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1、分離方法對移植卵巢卵泡發(fā)育的影響【摘要】　　目的評估機械法、酶解法和酶解機械結(jié)合法等分離方法對小鼠移植卵巢分離卵泡的發(fā)育及其生殖潛能的影響，建立更好的卵泡分離技術(shù)方案。方法B6D2F1新生小鼠卵巢移植后分別用機械法、長時酶解法、短時酶解法或酶解機械結(jié)合法分離卵巢組織中的腔前卵泡，分離回收卵泡在體外培養(yǎng)12d時加入絨毛膜促性腺激素(hCG)處理26h，收獲卵丘復合體進行體外受精。結(jié)果機械法的卵泡回收量、卵泡培養(yǎng)殘存率、排卵率均高于酶解法，短時酶解法的排卵率高于長時酶解法;酶解機械結(jié)合法的平均卵泡回收量、平均排卵數(shù)

2、、卵母細胞成熟率等多項指標均高于其他各組。結(jié)論酶解機械結(jié)合法是分離小鼠卵泡良好的技術(shù)方案?！娟P(guān)鍵詞】卵巢卵泡卵母細胞培養(yǎng)技術(shù)胚胎組織移植　　人工誘導胚胎卵巢原始卵泡發(fā)育成熟可為受精機制研究和醫(yī)療性克隆提供充足的卵母細胞源。對異體移植發(fā)育到一定程度的卵巢進行生長卵泡分離是人工誘導卵泡發(fā)育的關(guān)鍵步驟之一[13]，迄今已經(jīng)發(fā)展出兩種卵泡分離技術(shù)，包括酶解分離法和機械分離法。這兩種方法各有其缺點，使每個卵巢的卵泡回收率和成熟率均停留于較低水平。本研究探討了酶解法、機械法和酶解機械結(jié)合法等分離方法對小鼠移植卵巢分離卵泡的

3、發(fā)育及其生殖潛能的影響，以期建立更好的卵泡分離技術(shù)方案。13　　1材料與方法　　1.1動物C57BL/6(B6)雌鼠、DBA/2(D2)雄鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[合格證：SCXK(滬)2007005]，以B6雌鼠和D2雄鼠交配繁殖B6D2F1(F1)小鼠。小鼠飼養(yǎng)于恒溫(25℃)動物房單籠獨立通風系統(tǒng)(IVCII型，蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司)，光照14h，黑暗10h，自由飲水取食?！　?.2試劑αMEMHEPES(42360032)，αMEM(32571036)，膠原酶I(17100

4、017)，脫氧核糖核酸酶(DNaseI，18047019)及ITS(胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒混合物)均為美國Gibco公司產(chǎn)品;rFSH(注射用重組人促卵泡激素，瑞士Serono公司);LH(黃體生成素，美國Sigma公司);hCG(中國麗珠集團麗珠制藥廠);FCS(胎牛血清)，penicillin/streptomycin(青霉素/鏈霉素)及KSOM+AA(MR106D)均為美國Chemicon公司產(chǎn)品?！　?.3卵巢移植B6雌鼠(8～10周齡)與D2雄鼠(10周齡)4∶1合籠培育F1代，次日查到陰栓者記為E0.

5、5d;以20d為孕期，預產(chǎn)期前3d每日早晚查看孕鼠是否生產(chǎn);斷頸處死新生12h以內(nèi)F1小鼠，取出雙側(cè)卵巢待移植。異戊巴比妥(1513mg/mL)麻醉成年(8～10周)F1雌鼠(移植受體)。消毒小鼠背部，在肋脊角區(qū)做縱向切口進入腹腔，切除雙側(cè)卵巢，然后在左側(cè)腎被膜下植入新生小鼠卵巢2枚，層層縫合傷口。待受體鼠清醒后送回鼠舍?！　?.4卵泡分離新生小鼠卵巢移植14d后，將受體鼠斷頸處死，從腎被膜下取出移植的卵巢，卵巢移植物約2mm大小，表面可見豐富的重構(gòu)血管，在體視鏡下可清晰觀察到卵巢移植物中的卵泡。用1mL注射器(32

6、0310，美國BD公司)的針尖將每枚卵巢均勻橫切為2塊，4塊卵巢組織混合后隨機分組進行分離?！　?.4.1A組(單純機械法)將卵巢組織塊轉(zhuǎn)移至卵泡分離操作液(αMEMHEPES，10%FCS，100IU/mLpenicillin，100mg/mLstreptomycin，不含膠原酶和DNA酶)中，在帶有37℃恒溫熱盤(MATSU55SZX2A，奧林巴斯)的體視顯微鏡下，用精細尖鑷(直5#，T1181，中國淮安特申醫(yī)療器械有限公司)剝離卵巢中的卵泡。每隔5min，即將已剝離的完整卵泡轉(zhuǎn)移至事先裝有1mL卵泡培養(yǎng)

7、液(αMEM，5%FCS，0.1IU/mLFSH，0.01IU/mLLH，1%ITS)的35mm培養(yǎng)皿中。共分離4次，總時間約20min?！　?.4.2B組(長時酶解法)將卵巢組織塊用1mL注射器針尖均切為3小塊，置于500μL卵泡酶解液(αMEMHEPES，3mg/mL膠原酶I，1mg/mLDNaseI)中，在37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中消化20min，第20分鐘時將其從培養(yǎng)箱取出，用200μ13L移液槍吹吸消化液30次。在體視顯微鏡下將游離出的結(jié)構(gòu)完整的卵泡轉(zhuǎn)移至事先裝有1mL卵泡培養(yǎng)液的35

8、mm培養(yǎng)皿中?！　?.4.3C組(短時酶解法)將卵巢組織塊用1mL注射器針尖均切為3塊，置于500μL卵泡酶解液中，在37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中消化，每隔5min即從培養(yǎng)箱中將組織取出，用200μL移液槍吹吸消化液30次，在體視顯微鏡下觀察是否有游離的卵泡，如有則將卵泡迅速轉(zhuǎn)移至裝有1mL新鮮培養(yǎng)液的35mm培養(yǎng)皿中。共消化20