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《干擾afp蛋白表達的shrna表達載體的構建及活性鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、干擾AFP蛋白表達的shRNA表達載體的構建及活性鑒定作者：張國英劉明社趙中夫*張蕓楊慧武延雋【摘要】 目的：利用含報告基因EGFP的pGenesil-1質粒構建干擾AFP蛋白表達的短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)表達的載體，并進行活性鑒定。方法：設計表達短發(fā)夾RNA的互補DNA序列，經(jīng)退火成雙鏈，克隆至帶有U6啟動子的質粒載體pGenesil-1中，構建重組質粒，轉化大腸桿菌DH5α菌株，擴增，提取質粒，酶切鑒定后測序分析。構建正確的重組質粒經(jīng)脂質體轉染HepG2細胞，檢測轉染率和培養(yǎng)細胞上清
2、的AFP含量變化，確定重組質粒的活性。結果：構建了靶向AFP蛋白的2個shRNA重組質粒載體pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2。酶切鑒定和測序分析，shRNA編碼序列與設計的片段完全一致，經(jīng)酶切凝膠電泳證實載體構建成功。重組質粒有效轉染HepG2細胞并顯著抑制AFP表達。結論：成功構建具有活性的、能夠表達shRNA靶向干擾AFP蛋白的2個重組質粒載體?！娟P鍵詞】AFP蛋白 RNAi shRNA 重組質粒載體AbstractObjective：Toconstructtherecombina
3、ntplasmidexpressingtwoAFP-targetedshorthairpinRNA(shRNA)withpGenesil-1plasmidsvector,andDetecttheActivityof11RecombinantPlasmidinHepG2cells.Methods：TwopairsofDNAsequencesweredesignedandsynthesized,andformedcomplementarychainsbyannealingrespectively.Thentheobtained
4、products,siAFP1andsiAFP2,wereinsertedintoplasmidvectorpGenesil-1withU6promoter.TherecombinantplasmidsweretransformingintotheEscherichiacolistrainDH5αforscreeningandamplifying.ThesequenceanalysisoftheplasmidsandidentifiedbySalIdigestionwascarriedout.Thebiologicalac
5、tivityofrecombinantplasmidwasdetectedbytransfectingintotheHepG2cellline.Results：ThetwoAFP-targetedshRNAsexpressingframeweresuccessfullyinsertedintothepGensil-1plasmidvectorrespectively,andtheobtainedshRNAscodingsequenceswereconsistentwiththedesignedfragments.There
6、combinantplasmidinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.Conclusion：TheconstructionoftworecombinantplasmidsofAFP-targetedshRNAwassuccessful.TworecombinantplasmidsexpressingAFP-targetedshRNAinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.KeyWor
7、dsAFP；RNAinterference；ShorthairpinRNA；HepG2cells11長期以來，人們只是把AFP作為一個腫瘤標志物，用于原發(fā)性肝癌(HCC)的診斷指標之一。諸多研究關注于檢測甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）對原發(fā)性肝癌診斷運用，而對AFP和腫瘤細胞發(fā)生及增殖的關系并不完全清楚［１～3］。近年發(fā)展起來的RNA干擾（RNAinterference,RNAi）技術為探索AFP的生物學功能提供了有力的工具。RNAi技術是通過導入細胞19nt～23nt的小分子干擾RNA(small
8、interferenceRNA,siRNA)，降解同源mRNA，高效、特異性阻斷目的基因表達［４～7］。本研究針對人AFP基因設計了2個位點的shRNA表達序列，用人U6啟動子和RNApolymeraseⅢ(PolⅢ)終止信號，構建針對AFP的特異性shRNA真核表達載體，并轉染HepG2細胞鑒定活性，
