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1、干擾AFP蛋白表達(dá)的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及活性鑒定作者：張國英劉明社趙中夫*張蕓楊慧武延雋【摘要】 目的：利用含報(bào)告基因EGFP的pGenesil-1質(zhì)粒構(gòu)建干擾AFP蛋白表達(dá)的短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)表達(dá)的載體，并進(jìn)行活性鑒定。方法：設(shè)計(jì)表達(dá)短發(fā)夾RNA的互補(bǔ)DNA序列，經(jīng)退火成雙鏈，克隆至帶有U6啟動子的質(zhì)粒載體pGenesil-1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后測序分析。構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染率和培養(yǎng)細(xì)胞上清
2、的AFP含量變化，確定重組質(zhì)粒的活性。結(jié)果：構(gòu)建了靶向AFP蛋白的2個(gè)shRNA重組質(zhì)粒載體pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2。酶切鑒定和測序分析，shRNA編碼序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致，經(jīng)酶切凝膠電泳證實(shí)載體構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒有效轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并顯著抑制AFP表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建具有活性的、能夠表達(dá)shRNA靶向干擾AFP蛋白的2個(gè)重組質(zhì)粒載體。【關(guān)鍵詞】AFP蛋白 RNAi shRNA 重組質(zhì)粒載體AbstractObjective：Toconstructtherecombina
3、ntplasmidexpressingtwoAFP-targetedshorthairpinRNA(shRNA)withpGenesil-1plasmidsvector,andDetecttheActivityof11RecombinantPlasmidinHepG2cells.Methods：TwopairsofDNAsequencesweredesignedandsynthesized,andformedcomplementarychainsbyannealingrespectively.Thentheobtained
4、products,siAFP1andsiAFP2,wereinsertedintoplasmidvectorpGenesil-1withU6promoter.TherecombinantplasmidsweretransformingintotheEscherichiacolistrainDH5αforscreeningandamplifying.ThesequenceanalysisoftheplasmidsandidentifiedbySalIdigestionwascarriedout.Thebiologicalac
5、tivityofrecombinantplasmidwasdetectedbytransfectingintotheHepG2cellline.Results：ThetwoAFP-targetedshRNAsexpressingframeweresuccessfullyinsertedintothepGensil-1plasmidvectorrespectively,andtheobtainedshRNAscodingsequenceswereconsistentwiththedesignedfragments.There
6、combinantplasmidinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.Conclusion：TheconstructionoftworecombinantplasmidsofAFP-targetedshRNAwassuccessful.TworecombinantplasmidsexpressingAFP-targetedshRNAinhibitedeffectivelytheexpressionofAFPgeneinHepG2cells.KeyWor
7、dsAFP；RNAinterference；ShorthairpinRNA；HepG2cells11長期以來，人們只是把AFP作為一個(gè)腫瘤標(biāo)志物，用于原發(fā)性肝癌(HCC)的診斷指標(biāo)之一。諸多研究關(guān)注于檢測甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）對原發(fā)性肝癌診斷運(yùn)用，而對AFP和腫瘤細(xì)胞發(fā)生及增殖的關(guān)系并不完全清楚［１～3］。近年發(fā)展起來的RNA干擾（RNAinterference,RNAi）技術(shù)為探索AFP的生物學(xué)功能提供了有力的工具。RNAi技術(shù)是通過導(dǎo)入細(xì)胞19nt～23nt的小分子干擾RNA(small
8、interferenceRNA,siRNA)，降解同源mRNA，高效、特異性阻斷目的基因表達(dá)［４～7］。本研究針對人AFP基因設(shè)計(jì)了2個(gè)位點(diǎn)的shRNA表達(dá)序列，用人U6啟動子和RNApolymeraseⅢ(PolⅢ)終止信號，構(gòu)建針對AFP的特異性shRNA真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞鑒定活性，
