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《重組質(zhì)粒構(gòu)建》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、目錄實(shí)驗流程2實(shí)驗操作31.LB液體培養(yǎng)基的配置32.質(zhì)粒的提取43.瓊脂糖凝膠電泳54.PCR65.DNA片段的回收純化...................................................................76.目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化...........................................................87.菌種保藏…………………………………………………………...98.雙酶切反應(yīng)..1010實(shí)驗流程——質(zhì)粒構(gòu)建基因提取——1、2、3
2、PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因——4、3DNA片段回收——5、3目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化——6菌種保藏——7重組質(zhì)粒提取——2、3重組質(zhì)粒檢測：（1）PCR（2）雙酶切——8、5測序10實(shí)驗操作1．LB液體培養(yǎng)基的配置【器材】錐形瓶，燒杯，量筒，分析天平，藥匙，高壓蒸汽滅菌鍋，棉花，報紙，記號筆，麻繩，紗布等?！驹噭拷湍柑崛∥?YeastExtract)，胰蛋白胨（Tryptone)，NaCl【實(shí)驗步驟】1.LB液體培養(yǎng)基配方（配置1L培養(yǎng)基）：胰蛋白胨（Tryptone)10g酵母提取物(YeastExtract)5gNaCl10g若配
3、置50ml培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物：0.25g、胰蛋白胨：0.5g、NaCl:0.5g放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯。2．溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的單蒸水，用藥匙攪勻。待藥品完全溶解后，倒入50ml量筒中，補(bǔ)充水分到50ml，倒入錐形瓶中。3.包扎用棉塞或紗布封住瓶口，再在棉塞外包一層報紙，用繩子以活結(jié)形式捆扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。4.滅菌將上述培養(yǎng)基以1
4、.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入4°冰箱內(nèi)暫存。滅菌后，將錐形瓶放入烘箱烘干。烘干后，4°保存?！咀ⅰ?.燒杯、量筒、錐形瓶應(yīng)先用洗滌精洗干凈，再用單蒸水潤洗。2.滅菌后應(yīng)立即放入烘箱烘干。3.培養(yǎng)基存放時間不宜過長。102．質(zhì)粒的提取【器材】加樣槍、滅菌的Tip頭、滅菌的Ep管、離心機(jī)【試劑】滅菌水、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0【實(shí)驗步驟】第一次使用本試劑盒時，請將RNaseA1混濁液全部加入到So
5、lutionⅠ中，均勻混合后4℃保存。實(shí)驗操作前請將SolutionⅢ置于4℃（或冰上）預(yù)冷后使用。1.大腸桿菌的培養(yǎng)。從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至1～4ml的含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。注）培養(yǎng)液不宜過量，培養(yǎng)液過量時，會因菌量太大而溶菌不充分，純化時會影響質(zhì)粒的純度。2.取菌液，12,000rpm離心2分鐘，棄上清。3.用250μl的SolutionⅠ（含RNaseA1）充分懸浮細(xì)菌沉淀。注）注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器（Vortex）等劇烈振蕩使菌體充分懸浮。4.加入250μl的SolutionⅡ輕輕地
6、上下翻轉(zhuǎn)混合5～6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液。注）此步驟不宜超過5分鐘。5.加入400μl的4℃預(yù)冷的SolutionⅢ，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5～6次，直至形成緊實(shí)凝集塊，然后室溫靜置5分鐘。6.室溫12,000rpm離心10分鐘，取上清。注）此時4℃離心不利于沉淀沉降。7.將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。8.將上述操作6的上清液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。9.將500μl的RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。
7、10.將700μl的RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。注）請確認(rèn)RinseB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。11.重復(fù)操作步驟10。12.將SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm離心1分鐘。13.將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入60μl的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1分鐘。注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至60℃使用時有利于提高洗脫效率。14.12,00
8、0rpm離心1分鐘洗脫DNA。15.DNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。【注】提好的質(zhì)粒需標(biāo)明時間、名稱等。-20℃保存。103.瓊脂糖凝膠電泳【器材】分析天平，錐形瓶，量筒，微波爐，凝膠板，梳子，加樣槍，Tip頭，電泳槽，電泳儀，紫
