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《dna和rna提取原理和方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、核酸提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析主講人：劉召華唐維（修改）第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策內(nèi)容第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。前言第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介第二部分：DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第三部分：RNA提取方法簡(jiǎn)介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策第一部分：DNA提取方法簡(jiǎn)介DNA提取的幾種方法基因組DNA的
2、提取CTAB法SDS法其它DNA提取的幾種方法非基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線(xiàn)粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法基因組DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉
3、淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白）。CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防
4、止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法褐變CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA－CTAB法PVP（聚乙烯吡咯烷酮）PVP按其平均分子量大小分為四級(jí)，習(xí)慣上常以K值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實(shí)際上是與PV
5、P水溶液的相對(duì)粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用K值來(lái)表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。在研磨過(guò)程中加入PVP，其中的CO-N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類(lèi)被氧化的機(jī)會(huì)。同時(shí)向抽提液中加入還原劑β-巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－CTAB法SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離
6、析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取緩沖液2.65水浴60min,其間緩慢搖動(dòng)幾次。3.加入150ul的5mol/LKac,混勻,冰浴15min左右SDS法流程圖（以動(dòng)物組織為例）動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法基因組DNA－其它方法物理方式：玻
7、璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：基因組DNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料陰離子交換樹(shù)脂磁珠高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的?；蚪MDNA－其它方法濃鹽法：有機(jī)溶劑抽提法：密度梯度離心法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利
