血清γ球蛋白的分離、純化與鑒定的綜合實驗建立與

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1、血清γ球蛋白的分離、純化與鑒定的綜合實驗建立與【關(guān)鍵詞】綜合實驗生物化學(xué)γ球蛋白生物化學(xué)是研究生物體內(nèi)化學(xué)分子與化學(xué)反應(yīng)的科學(xué)，從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)［1］。生物化學(xué)基本理論的建立、完善和發(fā)展是以實驗研究為基礎(chǔ)［2］。而要完成開發(fā)學(xué)生的潛能，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力，培養(yǎng)大學(xué)生的綜合素質(zhì)這一任務(wù)的重要手段是在開設(shè)的綜合實驗中得以實現(xiàn)的［3］。我們依據(jù)最新教學(xué)大綱，結(jié)合實驗室現(xiàn)有的條件，對原有實驗內(nèi)容進(jìn)行了重新整合，力爭即有保留又有創(chuàng)新，設(shè)計了規(guī)模較大的綜合實驗“血清γ球蛋白的分離、純化與鑒定”。經(jīng)過反復(fù)實驗預(yù)試，并經(jīng)過一年（兩學(xué)期）醫(yī)學(xué)本科學(xué)生

2、的實驗教學(xué)證明，實驗方法穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)可靠，便于學(xué)生操作，教學(xué)效果良好。1材料與方法1.1儀器與材料1.1.1儀器KDC40低速離心機、1.5cm×20cm玻璃層析柱、722可見分光光度計、DYY2C電泳儀及DYCZ24D型垂直板電泳槽均為國產(chǎn)。1.1.2試劑材料新鮮豬血清、pH7.0飽和硫酸銨溶液、0.01mol/LpH7.0PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）、葡聚糖凝膠G25（SephadexG25）、奈氏（Nessler）試劑、20%（l，加入等量PBS和飽和硫酸銨溶液，混勻后靜止30min，3000rpm離心10min，沉淀物即是γ球蛋白。該步

3、驟可重復(fù)12次，以保證純度。將γ球蛋白通過SephadexG25層析作用，用PBS洗脫，除去蛋白質(zhì)中的小分子銨鹽，從而達(dá)到γ球蛋白純化的目的。洗脫下來的收集液可以用磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)的存在，用奈氏試劑檢測是否除凈NH4+,然后把含有γ球蛋白的樣品合并收集。把純化的γ球蛋白與正常豬血清樣品進(jìn)行醋酸纖維素膜電泳作對照驗證。把純化的γ球蛋白、正常豬血清樣品用雙縮脈試劑顯色后，用分光光度法測定其含量，并稀釋成2mg/ml。把純化的γ球蛋白、正常豬血清及標(biāo)準(zhǔn)蛋白（2mg/ml）分別用含巰基乙醇的樣品緩沖液處理，用12%分離膠進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電

4、泳(SDSPAGE)［4］，作進(jìn)一步對照驗證。2結(jié)果2.1醋酸纖維素膜電泳純化的γ球蛋白樣品為一條帶（γ球蛋白位置）；正常豬血清樣品為五條帶（清蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白）2.2SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳正常豬血清樣品出現(xiàn)十幾條帶，在清蛋白前面出現(xiàn)二條帶且與純化的γ球蛋白樣品出現(xiàn)的二條帶相平行。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為純一條帶且與正常豬血清樣品的清蛋白相平行，而純化的γ球蛋白樣品無明顯清蛋白，其它蛋白帶與正常豬血清樣品相比較顏色對應(yīng)變淺。3討論3.1目的原理血清中的γ球蛋白是一類結(jié)構(gòu)相似具有重要免疫功能的多種蛋白質(zhì)，它們的分子量多數(shù)在150KDa左右，基本

5、結(jié)構(gòu)由兩條分子量相同的輕鏈(Ｈ鏈23KDa)和兩條分子量相同的重鏈(Ｌ鏈55KDa)通過二硫鍵連接組成。分離、純化與鑒定γ球蛋白的方法很多，從設(shè)計的生化實驗?zāi)康目紤]，選用硫酸銨鹽析分離、葡聚糖凝膠純化γ球蛋白，不僅保證其相對純度，節(jié)省時間，更重要的是保證其完好的生物學(xué)活性。而用醋酸纖維素膜電泳和SDSPAGE，對蛋白質(zhì)進(jìn)行量化、比較及特性鑒定，是較為經(jīng)濟、快速且可重復(fù)的方法，尤其是SDSPAGE，已成為許多研究領(lǐng)域廣為應(yīng)用的重要分析技術(shù)。我們把純化的γ球蛋白、正常豬血清及標(biāo)準(zhǔn)蛋白用含有巰基乙醇的樣品緩沖液處理后進(jìn)行SDSPAGE，可使純化的γ球蛋

6、白、正常豬血清中的γ球蛋白還原成兩條分子量相同的輕鏈和兩條分子量相同的重鏈而出現(xiàn)二條帶，且相互平行；而標(biāo)準(zhǔn)蛋白不含二硫鍵，不能解鏈，故只出現(xiàn)一條帶且與正常豬血清中的清蛋白相平行。至于純化的γ球蛋白樣品除γ球蛋白解鏈為重輕鏈后的其它蛋白在鹽析時已分離出大部分，經(jīng)高靈敏度的SDSPAGE仍可不同層度的顯現(xiàn)出淺帶。3.2體會實驗樣品為豬血清，取材方便易得，同時節(jié)約了樣品的用量，本實驗只需1份(每1個小組)2ml血清樣品即可滿足所需；節(jié)省了實驗經(jīng)費的支出；對環(huán)境無污染；而標(biāo)準(zhǔn)蛋白采用單一成分為國產(chǎn)牛白蛋白（67KDa），價格低廉，而且電泳成帶清晰整齊，尤其適合

7、教學(xué)。結(jié)構(gòu)安排合理，難易適度，精簡了教學(xué)時數(shù)。綜合實驗共用16學(xué)時，分二次完成。第一次8學(xué)時，血清γ球蛋白的分離、純化與鑒定（一），完成血清γ球蛋白的分離、純化及醋酸纖維素膜電泳；第二次8學(xué)時，血清γ球蛋白的分離、純化與鑒定（二），完成γ球蛋白、正常豬血清樣品的定量和SDSPAGE,在時間上至少節(jié)省8學(xué)時。在學(xué)生實驗操作上，從刻度細(xì)管，可調(diào)玻璃加液器的使用到微量進(jìn)樣器，可調(diào)式移液器選用；從免疫抗體的分離、純化到化學(xué)的顯色和沉淀法的應(yīng)用以及分子解鏈電泳，整個實驗的基本理論清楚，有據(jù)可循，難易適度，循序漸進(jìn)。實驗技術(shù)全面，方法穩(wěn)定，使傳統(tǒng)與現(xiàn)代結(jié)合。綜合

8、實驗選用了生物化學(xué)較為代表，反映基本理