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《血清γ球蛋白分離、純化及鑒定綜合實驗建立及探析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、血清Y球蛋白分離、純化及鑒定綜合實驗建立及探析【關鍵詞】綜合實驗生物化學Y球蛋白生物化學是研究生物體內(nèi)化學分子與化學反應的科學，從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)［1］。生物化學基本理論的建立、完善和發(fā)展是以實驗研究為基礎［2］。而要完成開發(fā)學生的潛能，培養(yǎng)學生的創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力，培養(yǎng)大學生的綜合素質(zhì)這一任務的重要手段是在開設的綜合實驗中得以實現(xiàn)的［3］。我們依據(jù)最新教學大綱，結(jié)合實驗室現(xiàn)有的條件，對原有實驗內(nèi)容進行了重新整合，力爭即有保留又有創(chuàng)新，設計了規(guī)模較大的綜合實驗“血清V球蛋白的分離、純化與鑒定”。經(jīng)過反復實驗
2、預試，并經(jīng)過一年（兩學期）醫(yī)學本科學生的實驗教學證明，實驗方法穩(wěn)定，結(jié)果重復可靠，便于學生操作，教學效果良好。1材料與方法1.1儀器與材料1.1.1儀器KDC40低速離心機、1.5cmX20cm玻璃層析柱、722可見分光光度計、DYY2C電泳儀及DYCZ24D型垂直板電泳槽均為國產(chǎn)。1.1.2試劑材料新鮮豬血清、pH7.0飽和硫酸鐵溶液、0.01mol/LpH7.0PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)、葡聚糖凝膠G25(SephadexG25)、奈氏(Nessler)試劑、20%(W/V)磺基水楊酸溶液、pH8.6離子強度0
3、.06巴比妥緩沖液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS(十二烷基硫酸鈉)考馬斯亮藍R250、甘氨酸、Tris、BSA(牛血清白蛋白)等除SephadexG25(SWEDEN進口分裝)外均為國產(chǎn)。1.2方法取新鮮血清2ml,加入等量PBS和飽和硫酸鐵溶液，混勻后靜止30min,3000rpm離心lOmin,沉淀物即是Y球蛋白。該步驟可重復12次，以保證純度。將V球蛋白通過SephadexG25層析作用，用PBS洗脫，除去蛋白質(zhì)中的小分子鞍鹽，從而達到Y(jié)球蛋白純化的目的。洗脫下來的收集液可以用磺基水楊酸檢測蛋
4、白質(zhì)的存在，用奈氏試劑檢測是否除凈NH4+,然后把含有V球蛋白的樣品合并收集。把純化的Y球蛋白與正常豬血清樣品進行醋酸纖維素膜電泳作對照驗證。把純化的V球蛋白、正常豬血清樣品用雙縮脈試劑顯色后，用分光光度法測定其含量，并稀釋成加g/mlo把純化的Y球蛋白、正常豬血清及標準蛋白(2mg/ml)分別用含疏基乙醇的樣品緩沖液處理，用12%分離膠進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)[4],作進一步對照驗證。2結(jié)果2.1醋酸纖維素膜電泳純化的Y球蛋白樣品為一條帶（V球蛋白位置）；正常豬血清樣品為五條帶（清蛋白、Q1、
5、Q2、B及Y球蛋白）2.2SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳正常豬血清樣品出現(xiàn)十幾條帶，在清蛋白前面出現(xiàn)二條帶且與純化的Y球蛋白樣品出現(xiàn)的二條帶相平行。標準蛋白為純一條帶且與正常豬血清樣品的清蛋白相平行，而純化的Y球蛋白樣品無明顯清蛋白，其它蛋白帶與正常豬血清樣品相比較顏色對應變淺。3討論3.1目的原理血清中的丫球蛋白是一類結(jié)構(gòu)相似具有重要免疫功能的多種蛋白質(zhì)，它們的分子量多數(shù)在150KDa左右，基本結(jié)構(gòu)由兩條分子量相同的輕鏈（H鏈23KDa）和兩條分子量相同的重鏈（L鏈55KDa）通過二硫鍵連接組成。分離、純化與鑒定Y球蛋白
6、的方法很多，從設計的生化實驗目的考慮，選用硫酸鐵鹽析分離、葡聚糖凝膠純化V球蛋白，不僅保證其相對純度，節(jié)省時間，更重要的是保證其完好的生物學活性。而用醋酸纖維素膜電泳和SDSPAGE,對蛋白質(zhì)進行量化、比較及特性鑒定，是較為經(jīng)濟、快速且可重復的方法，尤其是SDSPAGE,已成為許多研究領域廣為應用的重要分析技術(shù)。我們把純化的V球蛋白、正常豬血清及標準蛋白用含有蔬基乙醇的樣品緩沖液處理后進行SDSPAGE,可使純化的V球蛋白、正常豬血清中的V球蛋白還原成兩條分子量相同的輕鏈和兩條分子量相同的重鏈而出現(xiàn)二條帶，且相互平行
7、；而標準蛋白不含二硫鍵，不能解鏈，故只出現(xiàn)一條帶且與正常豬血清中的清蛋白相平行。至于純化的Y球蛋白樣品除Y球蛋白解鏈為重輕鏈后的其它蛋白在鹽析時已分離出大部分，經(jīng)高靈敏度的SDSPAGE仍可不同層度的顯現(xiàn)出淺帶。3.2體會實驗樣品來源為豬血清，取材方便易得，同時節(jié)約了樣品的用量，本實驗只需1份（每1個小組）2inl血清樣品即可滿足所需；節(jié)省了實驗經(jīng)費的支出；對環(huán)境無污染;而標準蛋白采用單一成分為國產(chǎn)牛白蛋白（67KDa）,價格低而且電泳成帶清晰整齊，尤其適合教學。結(jié)構(gòu)安排合理，難易適度，精簡了教學時數(shù)。綜合實驗共用1
8、6學時，分二次完成。第一次8學時，血清V球蛋白的分離、純化與鑒定（一），完成血清Y球蛋白的分離、純化及醋酸纖維素膜電泳；第二次8學時，血清V球蛋白的分離、純化與鑒定（二），完成Y球蛋白、正常豬血清樣品的定量和SDSPAGE,在時間上至少節(jié)省8學時。在學生實驗操作上，從刻度細管，可調(diào)玻璃加液器的使用到微量進樣器，可調(diào)式移液器選用；從免疫抗體的分離
