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1、補(bǔ)腎康膝方對(duì)家兔軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響【摘要】 目的觀察補(bǔ)腎康膝方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖凋亡和端粒酶活性的影響。方法取兔的關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨細(xì)胞分離傳代后,分為補(bǔ)腎康膝方含藥血清組和對(duì)照組，置入37℃，50ml/L的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d后,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖;TUNEL法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞的凋亡；軟骨細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增后用ELISA檢測(cè)端粒酶活性。結(jié)果補(bǔ)腎康膝方高、中、低劑量組細(xì)胞增殖均高于對(duì)照組(P<0.05)；補(bǔ)腎康膝方含藥血清各組的軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；補(bǔ)腎康膝方含藥血清各組的軟骨細(xì)胞端粒酶活性明顯高于對(duì)照組。結(jié)論補(bǔ)腎康膝方
2、可能通過(guò)上調(diào)軟骨細(xì)胞端粒酶活性,從而抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。【關(guān)鍵詞】補(bǔ)腎方；軟骨細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；端粒酶 Abstract:ObjectiveToobservetheeffectsofkidney-supplementing,knee-invigorating(KSKI)Prescriptioncontainingserumonproliferationandapoptosisofrabbitchondrocytesinvitro.MethodsThechondrocytesthecartilageoftherabbits,andgroupsandcontrolgroup.Aftert
3、hechondrocytesl/LCO2incubator,thEirproliferation,apoptosisandthetelomeraseactivitygroupseraseactivitieseraseactivity. Keyenting；Knee-invigoratingprescription；Chondrocytes；Apoptosis；Telomerase 骨關(guān)節(jié)炎主要的病理特征是軟骨骨質(zhì)的降解和軟骨中細(xì)胞數(shù)目明顯減少，軟骨基質(zhì)的合成和分解代謝失調(diào)，最終關(guān)節(jié)軟骨被破壞。研究表明，軟骨中唯一的細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，軟骨基質(zhì)主要是由軟骨細(xì)胞合成和分泌的；軟骨細(xì)胞的分
4、裂增殖及凋亡的異常在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起到十分重要的作用。補(bǔ)腎康膝方是治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)早期骨關(guān)節(jié)炎療效顯著，本研究主要從補(bǔ)腎康膝方對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響探討其防治骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)和臨床運(yùn)用打下基礎(chǔ)?！ ?材料與儀器 1.1動(dòng)物 新西蘭兔1個(gè)月齡大，體質(zhì)量2.5kg，雌雄各5只，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供?！ ?.2試劑 胎牛血清(美國(guó)Sigma,使用前滅活)、Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Sigma)、1.0g/L胰蛋白酶、0.2g/LEDTA、DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)、二甲基亞砜、MTT(美國(guó)Sigma公司)、端粒酶PCR2ELISA檢測(cè)試劑盒(德國(guó)
5、BoehringerManheiman)、TUNEL成套試劑盒(湖北省武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品)?！ ?.3儀器設(shè)備 Olympus倒置顯微鏡、培養(yǎng)箱(HeraeusB25060EK2CO2)、超凈臺(tái)(上海凈化設(shè)備廠CSB21)、冷凍高速離心機(jī)(Heraeeus)、酶標(biāo)分析儀(KⅡ)?！ ?方法 2.1兔血清制備 新西蘭兔4只，雌雄各半。補(bǔ)腎康膝方(由淫羊藿、黃芪、牛膝、石斛、遠(yuǎn)志、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂等組成)按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量，再按10ml/d灌胃，正常兔血清以9.0g/L氯化鈉注射液按10ml/d灌胃。連續(xù)灌胃2次，中間間隔2h，分別在末次灌胃后3h采血。在乙醚和
6、氯胺酮復(fù)合麻醉下兔腹主動(dòng)脈采血，4℃冰箱過(guò)夜后，離心(2500r/min)25min，取上清液，抽濾除菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩！ ?.2兔軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)將6只新西蘭兔空氣栓塞處死后,無(wú)菌條件下截取雙側(cè)脛骨近端、股骨遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)軟骨，置于D-Hank's液中沖洗。0.5g/L透明質(zhì)酸酶溶液室溫下消化3min，將軟骨切成約1mm3大小，分別以2.0g/L胰蛋白酶、2.0g/L膠原酶溶液于37℃，50ml/LCO2培養(yǎng)箱中孵育60min，1500r/min離心3min，棄上清液，網(wǎng)篩過(guò)濾后,加入100ml/L小牛血清，反復(fù)吹打后將軟骨細(xì)胞接種在25cm2的培養(yǎng)瓶中，置37℃，50ml
7、/LCO2培養(yǎng)箱中。原代細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)?！ ?.3含藥血清的加入傳代細(xì)胞接種在24孔板中，接種密度2×104個(gè)/cm2，分對(duì)照組(正常兔血清)、補(bǔ)腎康膝方Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組(含藥血清分別為5%，10%，20%)。每組選6個(gè)培養(yǎng)孔，分別用相應(yīng)的血清培養(yǎng)?！ ?.4檢測(cè)方法及觀測(cè)指標(biāo) 2.4.1MTT比色法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)7d后，每孔加MTT20μl(5mg/ml)溶于PBS中，濾過(guò)除菌，放入培養(yǎng)箱4h，取出，每孔加入50μl二甲基亞砜，振蕩混
