中藥補(bǔ)腎方對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞影響

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1、中藥補(bǔ)腎方對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞影響趙瑜，馮齊鳳，朱祝生，劉日光【摘要】　　目的為了解中藥補(bǔ)腎方對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的作用。方法取TT法檢測細(xì)胞增殖；TUNEL法檢測各組軟骨細(xì)胞的凋亡。結(jié)果中藥補(bǔ)腎方高、中、低劑量組細(xì)胞增殖均高于對照組(P0.05)；中藥補(bǔ)腎方含藥血清各組的軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組(P0.05)。結(jié)論中藥補(bǔ)腎方可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖與抑制軟骨細(xì)胞的凋亡?！娟P(guān)鍵詞】補(bǔ)腎方細(xì)胞培養(yǎng)軟骨細(xì)胞　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofkidney-supplementingPrescriptionextractedfro

2、mtraditionalChinesemedicineonChondrocytesculturedinvitro.MethodsThechondrocytesthecartilageofEM培養(yǎng)液(Gibco)、二甲基亞砜、MTT(美國Sigma)、TUNEL成套試劑盒(湖北省武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品)。　　1.3鼠血清制備　　　EM全培養(yǎng)基（含100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，10-8M地塞米松，VitC50μg/ml），將細(xì)胞團(tuán)制成懸液，以200目篩網(wǎng)過篩，收集濾液，以6×106/ml密度接種，置37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次換液在3d后，其后每2

3、d換液1次，至細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時傳代?！　?.5含藥血清的加入　　　傳代細(xì)胞接種在24孔板中，接種密度2×104個/cm2,分對照組(正常血清)、補(bǔ)腎方實驗組(含藥血清分別為5%，10%，20%)。每組選6個培養(yǎng)孔，分別用相應(yīng)的血清培養(yǎng)?！　?.6MTT增殖測定軟骨細(xì)胞培養(yǎng)5d后，每孔加MTT20μl(5mg/ml)溶于PBS中,濾過除菌,放入培養(yǎng)箱4h，取出，每孔加入50μl二甲基亞砜，振蕩混勻使結(jié)晶物充分溶解。在全自動酶標(biāo)儀上檢測光密度(OD)值，檢測波長為492nm?！　?.7TUNEL法檢測軟骨細(xì)胞的凋亡按檢測試劑盒說明書操作。以胞漿出現(xiàn)棕色細(xì)小顆粒為陽性結(jié)果。陽性

4、率計算：計數(shù)5個視野中的陽性細(xì)胞核(胞漿)數(shù)及總細(xì)胞核數(shù)，并計算陽性細(xì)胞核數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)的百分比?！　?.8數(shù)據(jù)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)以±s表示?！　?結(jié)果　　不同濃度的補(bǔ)腎方含藥血清對培養(yǎng)軟骨細(xì)胞均顯示增殖刺激作用，與對照組比較P0.05。不同濃度的補(bǔ)腎方含藥血清對軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組,差異存在顯著性P0.05。結(jié)果見表1。表1補(bǔ)腎方對家兔軟骨細(xì)胞增殖、凋亡率（略）　　3討論　　骨關(guān)節(jié)炎是一種臨床常見的老年人關(guān)節(jié)的退行性病變，它的發(fā)病率與年齡密切相關(guān)。Cooper等〔1〕研究表明，60歲后，100%的人膝關(guān)節(jié)軟骨將發(fā)生組織學(xué)退

5、變；60%～70%的個體存在確定的膝OA證據(jù)。我國50歲以上的人群中骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率約為50%，而65歲以上患有此病的女性和男性分別高達(dá)90%和80%。　軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞，它與由其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)共同組成具有獨特力學(xué)和生物學(xué)特性的物質(zhì)，即軟骨。因此，軟骨細(xì)胞在軟骨形成、代謝以及修復(fù)中起著極其重要的作用。骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨丟失以及軟骨細(xì)胞功能降低或喪失為主要特征的一類退行性關(guān)節(jié)疾病。但軟骨的修復(fù)是一個復(fù)雜的組織學(xué)變化過程，軟骨細(xì)胞在骨關(guān)節(jié)炎修復(fù)中起著十分重要的作用。如何促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和延緩軟骨細(xì)胞凋亡，是需要研究的問題?！　≈嗅t(yī)藥學(xué)在骨關(guān)節(jié)病的臨床治療中

6、積累了豐富的經(jīng)驗，為了進(jìn)一步研究中醫(yī)藥延緩軟骨退變的作用機(jī)理，有必要建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。而中藥復(fù)方多數(shù)是通過口服而起作用的，用中藥粗制劑直接加入離體反應(yīng)體系中進(jìn)行實驗研究，在方法學(xué)上存在很多問題，如：中藥中的雜質(zhì)成分、各種電解質(zhì)或鞣質(zhì)、以及不同酸堿度的影響等，都會對實驗結(jié)果造成一定的影響〔2，3〕。而用含藥血清進(jìn)行體外實驗，可以排除以上各種因素的影響,比較接近藥物體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的過程。MTT光密度表達(dá)，反映了細(xì)胞增殖活性，反映一定時間的細(xì)胞增殖速度〔4〕。細(xì)胞凋亡的檢測方法主要包括形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等改變。其中最重要和特征性的改變是Ca2+

7、/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的激活導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核心小體連接部位斷裂，形成以180～200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。因此，細(xì)胞凋亡過程中DNA降解所產(chǎn)生的DNA片段大小具有獨特性質(zhì)，常作為細(xì)胞凋亡特異性指標(biāo)，其中TUNEL法則被廣泛應(yīng)用的方法之一。本實驗結(jié)果表明，中藥補(bǔ)腎方含藥血清各濃度組的軟骨細(xì)胞增殖OD值明顯高于對照組(P0.05)，說明其能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增生；而軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組(P0.05)，說明其具有抑制軟骨細(xì)胞的異常凋亡的功效；說明中藥補(bǔ)腎方能通過抑制軟骨細(xì)胞異常凋亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖從而起到防