rna干擾egfr基因對卵巢癌細胞化療敏感性的影響論文

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1、RNA干擾EGFR基因對卵巢癌細胞化療敏感性的影響論文【摘要】目的構建表皮生長因子受體(EGFR)基因的小干擾RNA（siRNA）質粒，轉染人卵巢癌細胞株skov3后檢測RNA干擾（RNAi）對EGFR基因表達及細胞對化療藥物敏感性的影響。方法體外構建EGFR小發(fā)卡狀RNA（shRNA）的表達質粒，脂質體法介導將其轉染入skov3細胞。實驗分為正常對照組、非特異性轉染組和特異性轉染組。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測EGFRmRNA的表達，使用免疫細胞化學法(ICC)檢測EGFR蛋白的表達。使用四甲基偶氮唑藍法（MTT）測定EGFRshRNA轉染

2、skov3細胞后細胞對順鉑敏感性的改變。結果EGFRshRNA轉染組細胞EGFRmRNA的表達與其他兩組相比明顯減弱（F=87.73，q=16.81、15.33,P0.01）,EGFR蛋白表達明顯下調（F=69.29，q=14.71、13.57，P0.01）；順鉑敏感性比正常對照組提高了約3倍。結論靶向EGFR基因的序列特異性shRNA可有效抑制skov3細胞中EGFR基因的表達，增強skov3細胞對順鉑的敏感性?！娟P鍵詞】卵巢腫瘤;受體,表皮生長因子;RNA干擾;順鉑［ABSTRACT］ObjectiveToconstructexpressionvect

3、orofEGFRspecificsiRNAandtransfectitintohumanovariancancercelllineskov3andtheninvestigatetheeffectofRNAinterference(RNAi)onthetargetgeneexpressionandchemosensitivityofthecellline.MethodsEGFRshRNAalcontrolcelllineandnonspecifictransfectantcelllinemunocytochemistryedtodetecttheinhib

4、itiveeffectofRNAionmRNAlevelandproteinlevel,respectively.Thechemosensitivitytocisplatinethod.ResultsTheexpressionofEGFRmRNAofsequencespecificshRNAtargetingEGFRehappenedtotheproteinexpression(F=69.29；q=14.71,13.57；P0.01),osensitivitytocisplatines.ConclusionTheEGFRspecificshRNAexpre

5、ssionvectorcaneffectivelysuppresstheexpressionlevelofEGFRgeneofskov3cells,andincreasesitschemosensitivitytocisplatin.［KEYidiprepSystem試劑盒的步驟提取并純化質粒待轉染。1.2.3細胞培養(yǎng)skov3細胞在含體積分數為0.10的胎牛血清、105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RMPI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、體積分數為0.05的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察記錄細胞的生長狀態(tài)。1.2.4轉染采用HifectinⅡ轉染

6、試劑轉染，按操作說明優(yōu)化轉染條件。實驗分為正常對照組、非特異性轉染組和特異性轉染組。正常對照組細胞不進行任何干預；非特異性轉染組轉染由Ambion公司質粒試劑盒所提供的非特異性質粒；特異性轉染組轉染pEGFRshRNA質粒。轉染前1d將細胞接種至6孔板，每孔5×105個細胞，轉染當天細胞約80％匯合，將構建好的質粒與HifectinⅡ混合成轉染復合物(質粒質量∶HifectinⅡ體積=1∶1.5),加入細胞中輕柔搖勻，置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中孵育24h后1∶2傳代，加300mg/L的G418篩選，3周后獲抗G418的陽性克隆，繼續(xù)

7、擴增培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。1.2.5RTPCR檢測轉染前后skov3細胞EGFRmRNA的表達按Trizol試劑說明書的要求提取細胞總RNA，按ReverseTranscriptionSystem的說明書采用特異性下游引物法反轉錄成cDNA。EGFR上游引物：5′AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT3′；EGFR下游引物：5′GGAAGTCCATCGACATGTTGCT3′,擴增產物長262bp。以βactin為內參照，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)25次后，72℃延伸10min。15g/L的瓊脂糖凝膠電

8、泳，紫外線透射觀察儀觀測、照相，用BandScan圖像分析軟件對結