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《環(huán)氧化酶－２基因和蛋白在人腎癌組織中的表達(dá)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、環(huán)氧化酶－２基因和蛋白在人腎癌組織中的表達(dá)作者：夏艷飛 陽冬芳 李海軍 曾令斌【摘要】目的探討環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因和蛋白在腎癌組織中的表達(dá)及與其分型之間的關(guān)系。方法收集經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)腎癌組織的標(biāo)本39例和正常腎組織8例,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及RNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果腎癌組織中的COX-2的基因和蛋白的表達(dá)明顯高于正常腎組織組(P<0.01)；在三種類型的腎癌中，混合型腎癌組織中COX-2表達(dá)最強(qiáng)，顆粒細(xì)胞癌的表達(dá)水平次之，腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)最少(P<0.01)。結(jié)論COX-2的基因和蛋白的表達(dá)在腎癌組織中
2、增高且與其病理分型密切相關(guān)?！ 娟P(guān)鍵詞】腎癌；環(huán)氧化酶-2；基因；蛋白質(zhì) 環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是前列腺素合成過程中的重要限速酶,它在某些腫瘤組織中高表達(dá),可能參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。腎癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤,發(fā)生率僅次于膀胱癌。本研究采用以外的正常腎臟組織8例為對照,經(jīng)病理檢查無癌細(xì)胞浸潤?！ ?.2主要試劑ReverseTranscriptionSystem購自美國Promega公司；COX-2及GAPDH上、下游引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)試劑?！ ?.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測腎
3、癌組織COX-2mRNA的表達(dá)用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，溶于無Rnase水中，紫外分光光度計(jì)測定OD260/OD280的比值在118~210。取總RNA2μg，用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物110μl進(jìn)行PCR循環(huán)。內(nèi)參照采用GAPGH，引物序列為:上游5′-AACTTTGGCATTGTG2GAAGG-3′，下游5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′，擴(kuò)增片段長度為599bp。COX-2引物序列：上游5′-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3′,下游5′-AGATCATCTCTGGCCTGAGTATCTTT-3
4、′,擴(kuò)增片斷長度305bp。PCR反應(yīng)條件：95℃溫育3min，94℃變性45s，60℃復(fù)性40s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，加樣量均為5μl，溴化乙錠染色。電泳條帶采用UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)做積分吸光度測定和分析，以各組目的基因與內(nèi)參照基因的RT-PCR擴(kuò)增DNA片段的吸光度值減去背景值的比值來比較待測基因的mRNA表達(dá)差異?！ ?.4A1h）至PDVF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2h后，按1∶1000比例加入兔抗人COX-1一抗，于室溫孵育1h；TBST洗滌3次，每次5min；按1∶100
5、0比例加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1h；TBST洗3次，每次5min；然后用RNA的表達(dá)RT-PCR分別檢測腎癌組織及正常腎組織COX-2mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常腎組織中，COX-2的基因表達(dá)很少，大部分呈陰性表達(dá)。而腎癌組織中其表達(dá)明顯增加，且三種類型的腎癌中，混合型腎癌組織中表達(dá)最強(qiáng)，腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)最少，而顆粒細(xì)胞癌的表達(dá)水平居中（結(jié)果如圖1）?！ ?.2腎癌組織及正常腎組織中COX-2蛋白的表達(dá)Western免疫印跡法分別檢測腎癌組織及正常腎組織COX-2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常腎組織中，COX-2蛋白表達(dá)較少，而腎癌組織中其表達(dá)明顯
6、增加，其中混合型腎癌織中表達(dá)最強(qiáng)，顆粒細(xì)胞癌的表達(dá)水平次之，腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)最少（結(jié)果如圖2）。 3討論 腎癌是腎臟最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率約占腎惡性腫瘤的80%,占全身惡性腫瘤的3%。其生物學(xué)行為多變，發(fā)病機(jī)制以及發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及預(yù)后仍不清楚。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)犬科動(dòng)物腎細(xì)胞癌模型體內(nèi)COX-2具有高表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞增長調(diào)節(jié)方面起重要作用，COX-2與腎盂移行細(xì)胞癌的分型和分期的具有相關(guān)性，而COX-2選擇性抑制劑可用于防治腎細(xì)胞癌［1-3］。 環(huán)氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin,PG)的一個(gè)限速酶，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣NPG產(chǎn)物
7、，維持機(jī)體的各種病理生理過程。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物COX至少有2種同工酶，即COX-1和COX-2，其中COX-2為誘導(dǎo)性表達(dá)，靜息時(shí)并不表達(dá)，在大多數(shù)正常組織難以發(fā)現(xiàn)，一般只在受刺激時(shí)迅速合成，這種刺激因子可為細(xì)胞因子、生長因子、促癌劑以及癌基因產(chǎn)物等。COX-2在致癌作用中充當(dāng)重要角色，研究發(fā)現(xiàn)它在人體結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、喉癌等組織中檢測到COX-2的高表達(dá)［4］。羅洪波等通過免疫組化研究認(rèn)為，腎細(xì)胞癌中COX-2的高
