間接elisa檢測抗血清效價(jià)

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1、間接ELISA檢測抗血清效價(jià)姓名：王賢臣學(xué)號：1125400080（成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)成都610500）【摘要】目的：通過實(shí)驗(yàn)掌握間接酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)（ELISA）的原理及操作過程及間接ELISA檢測抗血清效價(jià)的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化及效價(jià)的確定。方法：間接ELISA雙抗體夾心法對包被抗原及酶標(biāo)抗體工作濃度進(jìn)行探索。結(jié)果：經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)初步確定抗人白蛋白血清包被濃度和一二抗的濃度，然后在正式實(shí)驗(yàn)確定其濃度，從而再進(jìn)行研究。討論：間接ELISA檢測抗血清效價(jià)的影響因素。并將預(yù)實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果與確定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行對比，和分析在實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)?！娟P(guān)鍵詞】抗人白蛋白ABLELISA前

2、言：1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附測定用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展為體液標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。之一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持器免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原后抗體即保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加

3、入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大的放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。實(shí)驗(yàn)方法：預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案：1、材料與方法1.1儀器：洗板機(jī)（BIO-RADMODEL1575）SM自動化酶免疫分析儀（北京天石醫(yī)療用品制作所BIO-RAD680）電熱恒溫箱（上海恒科技儀器有限公司）移液槍（上海求精生化試劑儀器有限公司）微孔反應(yīng)板刻度吸管（5ml、1ml）吸耳球試管架塑料試管封口紙燒杯1.2試劑：人ALB標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA:A1653SIZE:250MGsto

4、rage:2-8℃）PBS緩沖液：0.1MpH7.4(PBS1L配方pH7.4：磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯化鈉(NaCl)8.0g，氯化鉀(KCl)0.2g，加水至1000mL)包被液：0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：0.05%Tween-PBS(即PBST)(0.05%Tween-PBS1000mlPBS加500ul吐溫）封閉液：1%干酪素-PBST（1%酪蛋白溶液100mlPBS加1g干酪素）顯色液（A液、B液Cat:ME002可溶性TMB顯色液)終止液：2MH2SO4酶標(biāo)抗體（兔抗羊-

5、-HRP，武漢博士德生物工程有限公司）1.3待測標(biāo)本：羊抗人ALB（效價(jià)1:70批號：201106貯存于4-20℃，有效期：2年）1.4方法：①預(yù)實(shí)驗(yàn)包被抗原(100ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加封閉液(300ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加入標(biāo)本(100ul/孔)↓37℃1h洗滌5次拍干加入酶標(biāo)抗體(100ul/孔)拍干↓37℃1h洗滌5次加入顯色劑A、B液各50ul/孔↓37℃15-20min加入終止液(100ul/孔)↓檢測表1：包被抗體和酶標(biāo)記抗體棋盤滴定羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊1:1:1:1:1:P兔抗羊1:1：1：

6、1：1：PIgG-HRP10401606402560BIgG-HR10401606402560BSPS1:5001:5001:2000人ALB：1:2000人ALB：1:800010ug/ml1:80001ug/ml1:160001:16000羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊1:1:1:1:1:P兔抗羊1:1：1：1：1：PIgG-HRP10401606402560BIgG-HR10401606402560BSPS1:5001:5001:2000人ALB：1:2000人ALB1:80000.1ug/ml1:80000.01ug/ml1：160001:16000（1

7、）將人ALB用包被液稀釋為：0.01ug/ml0.1ug/ml1ug/ml10ug/ml（2）酶標(biāo)結(jié)合物（兔抗羊IgG-HRP）稀釋為：1:5001:20001:80001:16000（3）抗人白蛋白血清（羊抗人ALB血清）稀釋為：1:101:401:1601:6401:2560在初步結(jié)果的基礎(chǔ)上繼續(xù)細(xì)化工作濃度，重新檢測以確定最終最適包被抗原和酶標(biāo)抗體的最終工作濃度，即建立間接ELISA法檢測抗人白蛋白血效價(jià)。②正式包被抗原(100ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加封閉液(300ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加