間接elisa檢測抗血清效價

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1、間接ELISA檢測抗血清效價姓名：王賢臣學(xué)號：1125400080（成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗成都610500）【摘要】目的：通過實驗掌握間接酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)（ELISA）的原理及操作過程及間接ELISA檢測抗血清效價的實驗條件優(yōu)化及效價的確定。方法：間接ELISA雙抗體夾心法對包被抗原及酶標抗體工作濃度進行探索。結(jié)果：經(jīng)過預(yù)實驗初步確定抗人白蛋白血清包被濃度和一二抗的濃度，然后在正式實驗確定其濃度，從而再進行研究。討論：間接ELISA檢測抗血清效價的影響因素。并將預(yù)實驗方法的結(jié)果與確定實驗的結(jié)果進行對比，和分析在實驗過程中的注意事項?！娟P(guān)鍵詞】抗人白蛋白ABLELISA前

2、言：1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附測定用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展為體液標本中微量物質(zhì)的測定方法。之一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持器免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原后抗體即保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加

3、入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大的放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。實驗方法：預(yù)實驗設(shè)計方案：1、材料與方法1.1儀器：洗板機（BIO-RADMODEL1575）SM自動化酶免疫分析儀（北京天石醫(yī)療用品制作所BIO-RAD680）電熱恒溫箱（上海恒科技儀器有限公司）移液槍（上海求精生化試劑儀器有限公司）微孔反應(yīng)板刻度吸管（5ml、1ml）吸耳球試管架塑料試管封口紙燒杯1.2試劑：人ALB標準品（SIGMA:A1653SIZE:250MGsto

4、rage:2-8℃）PBS緩沖液：0.1MpH7.4(PBS1L配方pH7.4：磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯化鈉(NaCl)8.0g，氯化鉀(KCl)0.2g，加水至1000mL)包被液：0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：0.05%Tween-PBS(即PBST)(0.05%Tween-PBS1000mlPBS加500ul吐溫）封閉液：1%干酪素-PBST（1%酪蛋白溶液100mlPBS加1g干酪素）顯色液（A液、B液Cat:ME002可溶性TMB顯色液)終止液：2MH2SO4酶標抗體（兔抗羊-

5、-HRP，武漢博士德生物工程有限公司）1.3待測標本：羊抗人ALB（效價1:70批號：201106貯存于4-20℃，有效期：2年）1.4方法：①預(yù)實驗包被抗原(100ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加封閉液(300ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加入標本(100ul/孔)↓37℃1h洗滌5次拍干加入酶標抗體(100ul/孔)拍干↓37℃1h洗滌5次加入顯色劑A、B液各50ul/孔↓37℃15-20min加入終止液(100ul/孔)↓檢測表1：包被抗體和酶標記抗體棋盤滴定羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊1:1:1:1:1:P兔抗羊1:1：1：

6、1：1：PIgG-HRP10401606402560BIgG-HR10401606402560BSPS1:5001:5001:2000人ALB：1:2000人ALB：1:800010ug/ml1:80001ug/ml1:160001:16000羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊1:1:1:1:1:P兔抗羊1:1：1：1：1：PIgG-HRP10401606402560BIgG-HR10401606402560BSPS1:5001:5001:2000人ALB：1:2000人ALB1:80000.1ug/ml1:80000.01ug/ml1：160001:16000（1

7、）將人ALB用包被液稀釋為：0.01ug/ml0.1ug/ml1ug/ml10ug/ml（2）酶標結(jié)合物（兔抗羊IgG-HRP）稀釋為：1:5001:20001:80001:16000（3）抗人白蛋白血清（羊抗人ALB血清）稀釋為：1:101:401:1601:6401:2560在初步結(jié)果的基礎(chǔ)上繼續(xù)細化工作濃度，重新檢測以確定最終最適包被抗原和酶標抗體的最終工作濃度，即建立間接ELISA法檢測抗人白蛋白血效價。②正式包被抗原(100ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加封閉液(300ul/孔)↓4℃過夜或37℃2h洗滌3次拍干加