專業(yè)技能實驗

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1、海南大學農學院專業(yè)實驗技能課程實驗報告姓名:李成梁學號:12071010210009年級:12^專業(yè):生物化學與分子生物學導師:陳惠萍教授序號實驗名稱成績1水稻糊粉層的剝取902水稻糊粉層總RNA的提取903反轉錄成cDNA804期終成績87水稻糊粉層的剝取一、實驗目的剝取水種子的糊粉層,為提取水稻糊粉層總RNA做準備二、實驗材料:水稻優(yōu)皿128種子三、實驗藥品和器材:1%高錳酸鉀溶液無菌水DEPC水滅菌后的培養(yǎng)皿、解剖針、解剖刀、濾紙無菌操作臺四、實驗方法與步驟1、用滅菌后的培養(yǎng)皿盛30粒種子,用1%高錳酸鉀溶液對種子消毒10分鐘后用無菌水沖洗3遍,倒入DEPC水

2、。2、在無菌操作臺上對材料種子去頭去尾、保留中間部分,放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。2、把裝有材料的培養(yǎng)皿轉移至無菌操作臺上,剝取谷売后剝取糊粉層。五、結果與分析可以獲得較好的水稻優(yōu)皿128種子的糊粉層水稻糊粉層總RNA的提取一、準備試劑(3?巰基乙醇,液氮,研缽,無RNase離心管,5MNaCI,氯仿,異丙醇,乃%乙醇,無RNase水(DEPC水丄二、方法步驟1,取不多于o.lg冷凍的研磨過的植物組織(15片糊粉層),加0.5ml提取試劑(4°C),振蕩至徹底混勻。冰上平放放置5min。2,4OC12,000rpm離心1min(2min),上清(約400ul)轉入新

3、的無RNase離心管,加入0.1ml5MNaCI,溫和混勻。3,加入0.3ml氯仿,上下顛倒混勻,4°C12,000rpm離心10min,取上層水相(約300ul)轉入新的無RNase離心管。注意:若提取富含多酚或淀粉的植物組織,可重復步驟5、6—次(離心時間15minX1,加與所得水相等體積的異丙醇(約150ul),混勻,室溫放置10mino2,4°C12,000rpm離心10min。棄掉上清,注意不要倒出沉淀。加1ml乃%乙醇。(沉淀可能很難看見,應小心操作。)3,4°C5,000rpm離心3min。倒出液體,注意不要倒出沉淀。剩余的少量液體短暫離心,然后用槍頭

4、吸出,室溫晾干2-3min。4,加50pi無RNase水(DEPC水),反復吹打、混勻,充分溶解RNA。如有絮狀物,可在室溫條件下12,000rpm離心1min,取上清轉入干凈的無RNase離心管中,-70°C保存。三、結果與分析獲得的產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證可用于后續(xù)的RT-PCR反轉錄成CDNA一、實驗材料已獲取的水稻優(yōu)皿128種子糊粉層二、實驗藥品FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)三、操作步驟50ng-2

5、Jg總RNA可建立20pi反應體系。1.將模板RNA在冰上解凍;5xgDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、lOxFastR

6、TBuffer、RNase-FreeddH20在室溫(15-25°C)解凍,解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻,簡短離心以收集殘留在管壁的液體。(以下操作步驟請在冰上進行。為了保證反應液配制的準確性,進行各項反應時,應先配制成Mix,然后再分裝到每個反應管中。)2.按照表1的基因組DNA的去除體系配制混合液,徹底混勻。簡短離心,并置于42°C,孵育3min。然后置于冰上放置。表1gDNA去除反應體系SxgDNABuffer2MlTotalRNA-8piRNase-FreeddH20補足到10

7、Jl(0

8、Jl)表2反轉錄反應體系lOxFastRTBuff

9、er2MlRTEnzymeMix1piFQ-RTPrimerMix2PlRNase-FreeddH2O補足到10

10、Jl4.將反轉錄反應中的Mix,加到gDNA去除步驟的反應液中,充分混勻。5.42°C,孵育15min。6.95°C,孵育3min之后放于冰上,得到的cDNA可用于后續(xù)實驗,或低溫保存。、實驗結果用試劑盒通常能夠獲得較好的cDNA

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