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1、海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院專業(yè)實驗技能課程實驗報告姓名：李成梁學(xué)號：12071010210009年級：12^專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)導(dǎo)師：陳惠萍教授序號實驗名稱成績1水稻糊粉層的剝?nèi)?02水稻糊粉層總RNA的提取903反轉(zhuǎn)錄成cDNA804期終成績87水稻糊粉層的剝?nèi)∫?、實驗?zāi)康膭內(nèi)∷N子的糊粉層，為提取水稻糊粉層總RNA做準(zhǔn)備二、實驗材料：水稻優(yōu)皿128種子三、實驗藥品和器材：1%高錳酸鉀溶液無菌水DEPC水滅菌后的培養(yǎng)皿、解剖針、解剖刀、濾紙無菌操作臺四、實驗方法與步驟1、用滅菌后的培養(yǎng)皿盛30粒種子，用1%高錳酸鉀溶液對種子消毒10分鐘后用無菌水沖洗3遍，倒入DEPC水
2、。2、在無菌操作臺上對材料種子去頭去尾、保留中間部分，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。2、把裝有材料的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至無菌操作臺上，剝?nèi)」葔雍髣內(nèi)『蹖?。五、結(jié)果與分析可以獲得較好的水稻優(yōu)皿128種子的糊粉層水稻糊粉層總RNA的提取一、準(zhǔn)備試劑（3?巰基乙醇，液氮，研缽，無RNase離心管，5MNaCI,氯仿，異丙醇，乃％乙醇，無RNase水（DEPC水丄二、方法步驟1,取不多于o.lg冷凍的研磨過的植物組織（15片糊粉層），加0.5ml提取試劑（4°C），振蕩至徹底混勻。冰上平放放置5min。2,4OC12,000rpm離心1min（2min）,上清（約400ul）轉(zhuǎn)入新
3、的無RNase離心管,加入0.1ml5MNaCI,溫和混勻。3,加入0.3ml氯仿，上下顛倒混勻，4°C12,000rpm離心10min,取上層水相（約300ul）轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管。注意：若提取富含多酚或淀粉的植物組織，可重復(fù)步驟5、6—次（離心時間15minX1,加與所得水相等體積的異丙醇（約150ul）,混勻，室溫放置10mino2,4°C12,000rpm離心10min。棄掉上清，注意不要倒出沉淀。加1ml乃％乙醇。（沉淀可能很難看見，應(yīng)小心操作。）3,4°C5,000rpm離心3min。倒出液體，注意不要倒出沉淀。剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭
4、吸出，室溫晾干2-3min。4,加50pi無RNase水（DEPC水），反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。如有絮狀物，可在室溫條件下12,000rpm離心1min,取上清轉(zhuǎn)入干凈的無RNase離心管中，-70°C保存。三、結(jié)果與分析獲得的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證可用于后續(xù)的RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成CDNA一、實驗材料已獲取的水稻優(yōu)皿128種子糊粉層二、實驗藥品FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）三、操作步驟50ng-2
5、Jg總RNA可建立20pi反應(yīng)體系。1.將模板RNA在冰上解凍；5xgDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、lOxFastR
6、TBuffer、RNase-FreeddH20在室溫（15-25°C）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，簡短離心以收集殘留在管壁的液體。（以下操作步驟請在冰上進(jìn)行。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項反應(yīng)時，應(yīng)先配制成Mix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中。）2.按照表1的基因組DNA的去除體系配制混合液，徹底混勻。簡短離心，并置于42°C,孵育3min。然后置于冰上放置。表1gDNA去除反應(yīng)體系SxgDNABuffer2MlTotalRNA-8piRNase-FreeddH20補(bǔ)足到10
7、Jl(0
8、Jl)表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系lOxFastRTBuff
9、er2MlRTEnzymeMix1piFQ-RTPrimerMix2PlRNase-FreeddH2O補(bǔ)足到10
10、Jl4.將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的Mix，加到gDNA去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻。5.42°C,孵育15min。6.95°C,孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后續(xù)實驗，或低溫保存。、實驗結(jié)果用試劑盒通常能夠獲得較好的cDNA
