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1、關于熒光染料（資料集合）l人肉眼對光源波長的顏色感覺紅色770-622nm橙色622~597nm黃色597~577nm綠色577~492nm藍靛色492～455nm紫色455～350nml理想的熒光染料一般具有以下幾個特點：1.具有高的光子產量，信號強度高；2.對激發(fā)光有較強的吸收，降低背景信號；3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間距離較大，減少背景信號的干擾；4.易與被標記的抗原、抗體或其他生物物質結合而不影響被標記物的特異性；5.穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、PH、標本抗凝劑和固定劑的影響。l染料在生物化學中最早的應用是直接對切片進行染色，然后進行觀察。隨著生物技術、計算機技術以及熒
2、光光譜測定技術的不斷發(fā)展，許多染料尤其是熒光染料在細胞檢測、腫瘤基因蛋白分析、毒物分析、臨床醫(yī)療診斷等方面得到了廣泛的應用。熒光染料泛指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一大于吸收光波長的光波的物質。利用熒光染料進行抗體標記分析在現(xiàn)代生物免疫學領域中應用廣泛，并逐步顯示出明顯的優(yōu)越性。下面簡要介紹應用于標記抗體的熒光染料及其種類：1.熒光素類染料，包括異硫氰酸熒光素(FITC)、羥基熒光素(FAM)、四氯熒光素(TET)等及其類似物。這是一類具有較多苯環(huán)的化合物。應用最廣泛的是FITC(如圖為FITC標記的組織熒光圖)，在488nm處由氬離子激光激發(fā)，發(fā)射525nm的藍綠色熒光
3、。FITC能夠與各種抗體蛋白結合，并在堿性溶液中穩(wěn)定呈現(xiàn)藍綠色熒光。2.羅丹明類染料，包括紅色羅丹明（RBITC）、四甲基羅丹明（TAMRA）、羅丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm處被激發(fā)可發(fā)射出570nm的黃色熒光。3.Cy系列菁染料，菁染料通常有兩個雜環(huán)體系組成，包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其類似物。4.Alexa系列染料，它是由MolecularProbes開發(fā)的系列熒光染料。其激發(fā)光和發(fā)射光光譜覆蓋大部分可見光和部分紅外線光譜區(qū)域，應用廣泛。以高亮度、穩(wěn)定性、儀器兼容性、多種顏色、pH值不敏感以及水溶性為主要特點
4、。包括AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、647、680、700、750。目前市面上Alexa系列染料應用非常廣泛，且逐漸替代傳統(tǒng)的熒光染料，如AlexaFluor488可替代FITC、Cy2；AlexaFluor555可替代Cy3、TAMRA；AlexaFluor633可替代APC、Cy5等。5.蛋白類的染料，包括藻紅蛋白（PE）、藻藍蛋白（PC）、別藻藍蛋白（APC）、多甲藻黃素-葉綠素蛋白（preCP）等。他們大多是在藍藻中發(fā)現(xiàn)的蛋白。這類熒光染料可以與Cy系列菁染料偶聯(lián)形成復合染料用于抗體標記。
5、如市面上常用的有PE-Cy3/Cy5/Cy7、APC-Cy7、PerCP-Cy5.5等。l【菁類染料-Cyaninedyes(Cy2,?Cy3,?Cy5)】Cy2耦聯(lián)基團激發(fā)波長為492nm，發(fā)光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應，在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團激發(fā)光的最大波長為550nm，最強發(fā)射光為570nm。因為激發(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC,在熒光顯微鏡中，
6、可使用和TRITC一樣的濾波片。Cy3在氬光燈(514nm或528nm)下可以被激發(fā)出50％的光強，在氦氖燈(543nm)或者汞燈(546nm)下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記。Cy5耦聯(lián)基團的激發(fā)波長最大650nm，發(fā)光波長最大670nm。在氪氬燈(647nm)下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下(633nm)為63％。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的最大發(fā)射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠紅外檢測器的
7、共聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應當加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。【藻紅蛋白或藻膽色素蛋白-Phycoerythrin(PE)熒光標記二抗】存在于被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應中心，在自然結構中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉化成能量，供其發(fā)育生長。當藻紅蛋白被分離和純化后，其蛋白質變得具有很強的熒光，能吸收不同波長的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時不再接受任何外來的光，也不能轉移光能。藻紅蛋白PE的吸收波長范圍較廣，最大的吸收波長為566nm，最大的發(fā)射波長為574nm。藻紅蛋白作為熒光
