關(guān)于熒光染料（資料集合）.doc

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1、關(guān)于熒光染料（資料集合）l人肉眼對(duì)光源波長(zhǎng)的顏色感覺(jué)紅色770-622nm橙色622~597nm黃色597~577nm綠色577~492nm藍(lán)靛色492～455nm紫色455～350nml理想的熒光染料一般具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1.具有高的光子產(chǎn)量，信號(hào)強(qiáng)度高；2.對(duì)激發(fā)光有較強(qiáng)的吸收，降低背景信號(hào)；3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間距離較大，減少背景信號(hào)的干擾；4.易與被標(biāo)記的抗原、抗體或其他生物物質(zhì)結(jié)合而不影響被標(biāo)記物的特異性；5.穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、PH、標(biāo)本抗凝劑和固定劑的影響。l染料在生物化學(xué)中最早的應(yīng)用是直接對(duì)切片進(jìn)行染色，然后進(jìn)行觀察。隨著生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及熒

2、光光譜測(cè)定技術(shù)的不斷發(fā)展，許多染料尤其是熒光染料在細(xì)胞檢測(cè)、腫瘤基因蛋白分析、毒物分析、臨床醫(yī)療診斷等方面得到了廣泛的應(yīng)用。熒光染料泛指吸收某一波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出另一大于吸收光波長(zhǎng)的光波的物質(zhì)。利用熒光染料進(jìn)行抗體標(biāo)記分析在現(xiàn)代生物免疫學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，并逐步顯示出明顯的優(yōu)越性。下面簡(jiǎn)要介紹應(yīng)用于標(biāo)記抗體的熒光染料及其種類：1.熒光素類染料，包括異硫氰酸熒光素(FITC)、羥基熒光素(FAM)、四氯熒光素(TET)等及其類似物。這是一類具有較多苯環(huán)的化合物。應(yīng)用最廣泛的是FITC(如圖為FITC標(biāo)記的組織熒光圖)，在488nm處由氬離子激光激發(fā)，發(fā)射525nm的藍(lán)綠色熒光

3、。FITC能夠與各種抗體蛋白結(jié)合，并在堿性溶液中穩(wěn)定呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光。2.羅丹明類染料，包括紅色羅丹明（RBITC）、四甲基羅丹明（TAMRA）、羅丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm處被激發(fā)可發(fā)射出570nm的黃色熒光。3.Cy系列菁染料，菁染料通常有兩個(gè)雜環(huán)體系組成，包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其類似物。4.Alexa系列染料，它是由MolecularProbes開(kāi)發(fā)的系列熒光染料。其激發(fā)光和發(fā)射光光譜覆蓋大部分可見(jiàn)光和部分紅外線光譜區(qū)域，應(yīng)用廣泛。以高亮度、穩(wěn)定性、儀器兼容性、多種顏色、pH值不敏感以及水溶性為主要特點(diǎn)

4、。包括AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、647、680、700、750。目前市面上Alexa系列染料應(yīng)用非常廣泛，且逐漸替代傳統(tǒng)的熒光染料，如AlexaFluor488可替代FITC、Cy2；AlexaFluor555可替代Cy3、TAMRA；AlexaFluor633可替代APC、Cy5等。5.蛋白類的染料，包括藻紅蛋白（PE）、藻藍(lán)蛋白（PC）、別藻藍(lán)蛋白（APC）、多甲藻黃素-葉綠素蛋白（preCP）等。他們大多是在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)的蛋白。這類熒光染料可以與Cy系列菁染料偶聯(lián)形成復(fù)合染料用于抗體標(biāo)記。

5、如市面上常用的有PE-Cy3/Cy5/Cy7、APC-Cy7、PerCP-Cy5.5等。l【菁類染料-Cyaninedyes(Cy2,?Cy3,?Cy5)】Cy2耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)為492nm，發(fā)光為波長(zhǎng)510nm的綠色可見(jiàn)光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)，在染色片儲(chǔ)存后會(huì)導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散。Cy3和Cy5比其他的熒光團(tuán)探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)光的最大波長(zhǎng)為550nm，最強(qiáng)發(fā)射光為570nm。因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)很接近TRITC,在熒光顯微鏡中，

6、可使用和TRITC一樣的濾波片。Cy3在氬光燈(514nm或528nm)下可以被激發(fā)出50％的光強(qiáng)，在氦氖燈(543nm)或者汞燈(546nm)下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo)。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。Cy5耦聯(lián)基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)最大650nm，發(fā)光波長(zhǎng)最大670nm。在氪氬燈(647nm)下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下(633nm)為63％。Cy5可以和很多其他的熒光基團(tuán)一起用在多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中。由于它的最大發(fā)射波長(zhǎng)在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時(shí)采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的

7、共聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應(yīng)當(dāng)加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時(shí)，不推薦使用Cy5?！驹寮t蛋白或藻膽色素蛋白-Phycoerythrin(PE)熒光標(biāo)記二抗】存在于被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應(yīng)中心，在自然結(jié)構(gòu)中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉(zhuǎn)化成能量，供其發(fā)育生長(zhǎng)。當(dāng)藻紅蛋白被分離和純化后，其蛋白質(zhì)變得具有很強(qiáng)的熒光，能吸收不同波長(zhǎng)的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時(shí)不再接受任何外來(lái)的光，也不能轉(zhuǎn)移光能。藻紅蛋白PE的吸收波長(zhǎng)范圍較廣，最大的吸收波長(zhǎng)為566nm，最大的發(fā)射波長(zhǎng)為574nm。藻紅蛋白作為熒光