-%2713-c代謝通量分析介紹，改良和應(yīng)用

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1、摘要摘要近十年來，系統(tǒng)生物學(xué)的概念和理論得到了迅速的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)的研究在各處如火如荼地開展。系統(tǒng)生物學(xué)的核心便是要整合各個層面，各個構(gòu)成要素的知識。這些層面當(dāng)中，除開耳熟能詳?shù)幕蚪M，轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組和表型組外，代謝組(Metabolome)和通量組(Fluxome)成為越來越重要一個組成部分。對這兩個體系的研究產(chǎn)生兩個新的組學(xué)，一個是代謝物組學(xué)(Metabonomics)，一個是代謝通量組學(xué)(Fluxomics)。前者重點(diǎn)對目標(biāo)體系內(nèi)的所有代謝物進(jìn)行定性和定量，而后者則重點(diǎn)對目標(biāo)體系內(nèi)的代謝通量的速率的方向和大小進(jìn)行測定。這些信

2、息對刻畫生物系統(tǒng)的生理特性、評估遺傳和環(huán)境對細(xì)胞的影響具有重要意義。另一方面，通過識別特定的遺傳操作和環(huán)境條件的控制，以增強(qiáng)生物技術(shù)過程的產(chǎn)率及生產(chǎn)能力的現(xiàn)代代謝工程也在快速發(fā)展中。代謝工程一個前提就是要量化代謝通量并將其與工程分析方法和分子生物學(xué)綜合技術(shù)結(jié)合。因此，這也對通量組(Fluxome)學(xué)的發(fā)展提出了更高要求。代謝通量組學(xué)的主要研究手段是代謝通量分析，它可以分為純計量性代謝通1313量分析和C代謝通量分析兩種。其中C代謝通量分析是近十多年來，國際上新發(fā)展并仍然處于發(fā)展當(dāng)中的技術(shù)。它除開具有純計量性代謝通量分析的能力外，還具有

3、獲取信息更多，適用范圍更廣的優(yōu)點(diǎn)。它能獲得代謝途徑的交換通量，并且不依賴于除穩(wěn)態(tài)假設(shè)外的其他生理假設(shè)，因而適用各種試驗(yàn)條件。國內(nèi)已經(jīng)有很多家單位開展了代謝物組學(xué)和純計量性代謝通量分析的研究，并取得了不錯13的結(jié)果。但是對于C代謝通量分析技術(shù)，國內(nèi)還未見有博士論文專題研究。13本博士論文的內(nèi)容主要分成三部分，分別是介紹C代謝通量分析平臺，對1313C質(zhì)量同模子檢測技術(shù)進(jìn)行了發(fā)展，并利用C代謝通量分析研究了大腸肝菌在超氧化應(yīng)激情況下中心代謝通量的變化情況，得到一些有趣的結(jié)果。1313論文的第一章闡述了C代謝通量分析平臺的建立。這包括C代謝

4、通量分析的理論綜述和實(shí)驗(yàn)平臺建立描述。I摘要13第一章的第一部分詳細(xì)介紹了C代謝通量分析的基本理論。代謝通量分析的基礎(chǔ)是代謝通量擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)。在此假設(shè)基礎(chǔ)上，可以建立各個代謝物的物質(zhì)平131313衡方程。C代謝通量分析實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)底物里引不完全C標(biāo)記。C會分布到13所有代謝物中，而由于C在代謝物中數(shù)量和位置的不同，可以得到同一種物質(zhì)13的不同的C同模子和質(zhì)量同模子(同模子的一類特殊組合形式)。從同模子概念出發(fā)，通過原子轉(zhuǎn)移矩陣和同模子轉(zhuǎn)移矩陣，可以將物質(zhì)平衡方程推廣到同模子守恒方程。通過對中間代謝物建立同模子守恒方程組，可以得到代謝通量相

5、對通量和代謝物的同模子分布之間的確定但是隱式關(guān)系。這個關(guān)系是一個較為復(fù)雜的多元二次方程組。當(dāng)我們測量了同模子分布的信息，依據(jù)此大規(guī)模的方程組和參數(shù)優(yōu)化的數(shù)值方法，可以反推出代謝通量相對通量。同時，通過構(gòu)建理論的測量值空間，利用MonteCarlo采樣，仿照此求解過程，可以估計代謝通量的置信區(qū)間。13第一章的第二部分詳細(xì)介紹了C代謝通量分析的檢測技術(shù)對于估計最后的代謝通量而言，我們需要獲取兩方面的信息。一方面是關(guān)于同模子比例的信息。通過核磁波譜，可以獲得特定的同模子組合的比例信息。這13包括非恒時的HSQC脈沖序列，它主要用于測量，單鍵

6、相連接的C異構(gòu)體組合；13HSQC(HMQC)-TOCSY，用于測量包含多個鍵的C異構(gòu)體組合。通過質(zhì)譜，可以測量質(zhì)量同模子比例的信息。另一方面是關(guān)于代謝物流出代謝體系的量值信息。一部分中間代謝物的流出量值通過細(xì)胞的生物質(zhì)的質(zhì)量和成分構(gòu)成；還有一部分中間代謝物的流出量值，通過測量這些中間代謝物在培養(yǎng)液中的殘留濃度來獲取。13論文的第二章闡述了對C質(zhì)量同模子檢測技術(shù)所作的改進(jìn)，改進(jìn)后的方法13可以提高質(zhì)量同模子比例的測量確度，從而提高C代謝通量分析的準(zhǔn)確度。13第二章的第一部分詳細(xì)介紹了用質(zhì)譜進(jìn)行C質(zhì)量同模子檢測的基本假設(shè)，并對該假設(shè)進(jìn)行

7、了數(shù)學(xué)化的描述。利用該數(shù)學(xué)描述，對之前的各種提高質(zhì)譜測量確度的方法進(jìn)行了分類和描述。這些方法分可分為線形插值，構(gòu)建非線性對應(yīng)關(guān)系，以及進(jìn)行理論修正等幾類。這些方法都有非常明顯的效果，但有一個共同的缺點(diǎn)，就是只針對某一種特定類型的質(zhì)譜，不具有普適性。II摘要13第二章的第二部分又分兩塊，第一塊是關(guān)于如何提高C質(zhì)量同模子檢測確度的方法。利用已知了同模子比例的樣品，作為標(biāo)準(zhǔn)樣，制作任意質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)曲線，是一種最具有廣泛性的提高測量精度的方法。我們使用以甲醇作為碳源的嗜甲基菌Methylobacteriumsalsuginissp.，將其在排

8、除了天然CO2的環(huán)境下，以13C標(biāo)記的甲醇作為唯一碳源培養(yǎng)。產(chǎn)生的各種生成物的同模子比例可以用二項13式公式來計算。我們引進(jìn)一個新的量，它是兩個連續(xù)的質(zhì)量同模子(C原子數(shù)目相差1)的比值，由此避開了對多維向量進(jìn)行校準(zhǔn)的麻