-%2713-c代謝通量的分析平臺(tái)建立和改良

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1、摘要摘要近十年來(lái)，系統(tǒng)生物學(xué)的概念和理論得到了迅速的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)的研究如火如荼地開(kāi)展。系統(tǒng)生物學(xué)的核心是要整合各個(gè)層面，各個(gè)構(gòu)成要素的知識(shí)。這些層面當(dāng)中，除開(kāi)耳熟能詳?shù)幕蚪M，轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組和代謝組外，通量組(Fluxome)成為越來(lái)越重要一個(gè)組成部分。對(duì)這個(gè)體系的研究產(chǎn)生了新的組學(xué)，即代謝通量組學(xué)(Fluxomics)。其重點(diǎn)是對(duì)目標(biāo)體系內(nèi)的代謝通量的速度的方向和取值進(jìn)行測(cè)定。所獲得的信息對(duì)刻畫(huà)生物系統(tǒng)的生理特性、評(píng)估遺傳和環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響具有重要意義。代謝通量組學(xué)的主要研究手段是代謝通量分

2、析，它可以分為純計(jì)量性代謝通量分析和”C代謝通量分析兩類(lèi)。其中13C代謝通量分析是近十多年來(lái)，國(guó)際上新發(fā)展并仍然處于發(fā)展當(dāng)中的技術(shù)。它除開(kāi)具有純計(jì)量性代謝通量分析的能力外，還具有獲取信息更多，適用范圍更廣的優(yōu)點(diǎn)。它能獲得代謝途徑的交換通量，并且不依賴(lài)于除穩(wěn)態(tài)假設(shè)外的其他生理假設(shè)，因而適用各種試驗(yàn)條件。但是對(duì)于13C代謝通量分析技術(shù)，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有博士論文專(zhuān)題研究。本博士論文的內(nèi)容主要分成二部分，一部分描述在中國(guó)科技大學(xué)建立13C代謝通量分析平臺(tái)的工作，另一部分是對(duì)通量分析平臺(tái)中的13C質(zhì)量同位素異構(gòu)體

3、檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)的工作。第～章詳細(xì)介紹了13C代謝通量分析的基本理論。代謝通量分析的基礎(chǔ)是代謝通量擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)。在此假設(shè)基礎(chǔ)上，可以建立各個(gè)代謝物的物質(zhì)平衡方程。13C代謝通量分析實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)底物里引入不完全的13C標(biāo)記。13C會(huì)分布到所有代謝物中，而由于13C在代謝物中數(shù)量和位置的不同，可以得到同一種物質(zhì)的不同的13C同位素異構(gòu)體和質(zhì)量同位素異構(gòu)體(同位素異構(gòu)體的～類(lèi)特殊組合形式)。從同位素異構(gòu)體概念出發(fā)，通過(guò)原子轉(zhuǎn)移矩陣和同位素異構(gòu)體轉(zhuǎn)移矩陣，可以將物質(zhì)平衡方程推廣到同位素異構(gòu)體守恒方程。通過(guò)對(duì)中間

4、代謝物建立同位素異構(gòu)體守恒方程組，可以得到代謝通量和代謝物的同位素異構(gòu)體分布之間的確定但是隱式的關(guān)系。這個(gè)關(guān)系是～個(gè)較為復(fù)雜的多元二次方程組。當(dāng)我們測(cè)量了同位素異構(gòu)體分布的信息，依據(jù)此大規(guī)模的方程組和參數(shù)I摘要優(yōu)化的數(shù)值方法，可以反推出代謝通量。同時(shí)，通過(guò)構(gòu)建理論的測(cè)量值空間，利用MonteCarlo采樣，仿照此求解過(guò)程，可以估計(jì)代謝通量的置信區(qū)間。第二章的主要內(nèi)容是13C通量分析平臺(tái)的建立和實(shí)例研究。第二章的第一部分詳細(xì)介紹了13C代謝通量分析的檢測(cè)技術(shù)。首先，詳細(xì)介紹了13C標(biāo)記技術(shù)，這是進(jìn)行1

5、3C代謝通量分析的基礎(chǔ)。對(duì)于估計(jì)最后的代謝通量而言，我們還需要獲取兩方面的信息。一方面是關(guān)于同位素異構(gòu)體比例的信息。通過(guò)核磁(Nuclearmagneticresonance,ⅫⅥR)波譜，可以獲得特定的同位素異構(gòu)體組合的比例信息。這包括J-resovledHSQC脈沖序列，它主要用于測(cè)量單鍵相連接的13C異構(gòu)體組合。通過(guò)質(zhì)譜(Massspectrometry,MS)，可以測(cè)量質(zhì)量同位素異構(gòu)體比例的信息。另一方面是關(guān)于代謝物流出代謝體系的量值信息。一部分中間代謝物的流出量值通過(guò)細(xì)胞的生物質(zhì)的質(zhì)量和成

6、分構(gòu)成；還有一部分中間代謝物的流出量值，通過(guò)測(cè)量這些中間代謝物在培養(yǎng)液中的殘留濃度來(lái)獲取。最后介紹了參數(shù)優(yōu)化的目標(biāo)函數(shù)和置信區(qū)間估計(jì)的方法。第二章的第二部分，以連續(xù)培養(yǎng)的大腸桿菌JMl01株的代謝通量分析為例子，描述了連續(xù)培養(yǎng)下進(jìn)行13C代謝通量分析的完整流程，也就是13C代謝通量分析實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立和實(shí)現(xiàn)。第三章闡述了對(duì)13C質(zhì)量同位素異構(gòu)體檢測(cè)技術(shù)所作的改進(jìn)。改進(jìn)后的方法可以提高質(zhì)量同位素異構(gòu)體比例的測(cè)量確度，從而提高13C代謝通量分析的準(zhǔn)確度。第三章的第一部分首先粗略地介紹了質(zhì)譜測(cè)量的原理和基本

7、過(guò)程。然后按照測(cè)量發(fā)生的順序，介紹了質(zhì)譜儀的基本的結(jié)構(gòu)和功能單元。這些單元包括進(jìn)樣器，離子源，質(zhì)量分析儀和信號(hào)檢測(cè)器。之后論文較為詳細(xì)地描述了用于氣質(zhì)聯(lián)用的衍生化方法，特別是氨基酸的特丁基二甲基硅烷衍生化方法。最后，仔細(xì)地討論了用以解決重同位素引起的質(zhì)量位移作用的數(shù)學(xué)框架修正舉證。第三章的第二部分首先詳細(xì)介紹了用質(zhì)譜進(jìn)行13C質(zhì)量同位素異構(gòu)體檢測(cè)的基本假設(shè)，并對(duì)該假設(shè)進(jìn)行了數(shù)學(xué)化的描述。利用該數(shù)學(xué)描述，對(duì)之前的各種提高質(zhì)譜測(cè)量確度的方法進(jìn)行了分類(lèi)和描述。之后則介紹了如何提高13C質(zhì)量同位II摘要素異

8、構(gòu)體測(cè)量確度的方法。利用已知了同位素異構(gòu)體比例的樣品，作為標(biāo)準(zhǔn)樣，制作任意質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)曲線，是一種最具有廣泛性的提高測(cè)量精度的方法。我們使用以甲醇作為碳源的嗜甲基菌Methylobacteriumsalsuginissp．，將其在排除了天然C02的環(huán)境下，以13C標(biāo)記的甲醇作為唯一碳源來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。產(chǎn)生的各種生成物的同位素異構(gòu)體比例可以用二項(xiàng)式公式來(lái)計(jì)算。我們引進(jìn)一個(gè)新的量，它是兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)量同位素異構(gòu)體(13C原子數(shù)目相差1)的比值，由此避開(kāi)了對(duì)多維向量進(jìn)行校準(zhǔn)的麻煩