dek在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)及功能的研究

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1、·中文論著摘要·DEK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及功能研究刖菁DEK是一種原癌基因，定位在6p22．3染色體，在急性髓系白血病(AML)的一亞型中第一次被報道。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、宮頸癌、惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤以及成年人急性白血病中，DEK蛋白均出現(xiàn)過表達(dá)。DEK能部分抑制細(xì)胞的分化和過早衰老，并與惡性細(xì)胞抗凋亡相關(guān)。這些研究提示DEK在腫瘤細(xì)胞中有多種功能，是一個重要癌基因。但是DEK在tH,細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況與臨床病理因素的關(guān)系還不清楚，其對肺癌細(xì)胞的作用及其作用機制未見文獻報道。我們檢測非小細(xì)胞肺癌中DEK的表達(dá)情況

2、，分析了DEK表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，通過干擾肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，SPC中DEK的基因表達(dá)，探討了DEK對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及凋亡影響。材料與方法1、組織來源112例原發(fā)性tH,細(xì)胞肺癌標(biāo)本及38例相應(yīng)正常肺組織標(biāo)本來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔蠟塊，患者術(shù)前均未接受放化療。男性72例，女性40例，年齡36--76歲，平均年齡6l歲。按2004年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌48例，腺癌64例；高分化41例，中分化47例，低分化24例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：l期55例，Il期

3、33例，III期24例。2、免疫組織化學(xué)染色免疫組化檢測試劑盒和濃縮型DAB試劑盒為福建邁新生物工程有限公司產(chǎn)品，DEK多克隆抗體為ProteinTechGroup中國分公司．武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。操作步驟簡略為：將石蠟組織塊切成49m厚的切片，脫蠟，脫水，在檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中修復(fù)后，按SP法操作步驟進行，一抗用抗DEK的多克隆抗體(1：200)40c孵育過夜，生物素標(biāo)記的二抗370C孵育30分鐘，DAB顯色，蘇木素染色。為證明DEK蛋白抗體免疫組化檢測的特異性，實驗中以鼠IgG代替一抗作為對照，結(jié)果陰性。同時，選擇DEK蛋白陽性染色的切片，以PBS

4、代替一抗的染色結(jié)果為陰性作為可信的實驗依據(jù)。3、免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判定：以棕褐色顆粒位于細(xì)胞核內(nèi)判定為DEK陽性染色結(jié)果。并根據(jù)Beesley分級法，按陽性細(xì)胞數(shù)的比例將染色結(jié)果分為4級。O級：陽性細(xì)胞數(shù)為0,--5％；1級：陽性細(xì)胞數(shù)為6‰25％：2級：陽性細(xì)胞數(shù)為26％～50％；3級：陽性細(xì)胞數(shù)為50％以上。同時，計算陽性率的方法設(shè)定為：(1)陽性率：指l級和l級以上的陽性染色病例百分?jǐn)?shù)；(2)強陽性率：指2級和2級以上的陽性染色病倒百分?jǐn)?shù)。4、細(xì)胞培養(yǎng)和siIⅢA干擾人肺腺癌A549細(xì)胞系用含有10％胎牛血清和100U／mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基

5、，肺癌細(xì)胞系SPC用含有10％胎牛血清和100U／mL青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，均在37。C，5％C02條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞按50％密度接種于6孔板，采用DharmaFECT1轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48小時后使用PCR和Westernblot檢測干擾效率。5、Rr．PCR對于培養(yǎng)的細(xì)胞或者剪碎的組織利用Trizol試劑(Invitrogen，USA)裂解，然后按照說明書的步驟，提取總的RNA。我們使用AMVVer3．0(Takara，Shiga，Japan)試劑盒。PCR產(chǎn)物通過2％的瓊脂糖凝膠電泳，采用(ImageJ)Bio—Imag

6、ingSystem進行灰度值測定，以p-aetin作為內(nèi)參。6、WesternBlot法檢測蛋自表達(dá)收集細(xì)胞加入裂解液充分裂解，低溫高速離心f4℃，15000轉(zhuǎn)／min，15min)，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60I．tg。電泳(10％SDS—PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印(50V,90min)、5％正常小牛血清封閉，抗DEK(1：2000,proteinTech)和抗13-actin(1：500)，4"C孵育過夜，分別與對應(yīng)的二抗(1：4000，santacruz，USA)室溫孵育2h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(ChemiImager5500，Al

7、phaInnotech，USA)2采集，進行灰度值測定。7、MTT法檢測細(xì)胞增殖及集落形成實驗將單個細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100ul含3．5x103個細(xì)胞，培養(yǎng)24hr，每孔加入MTr(3-【4，5-2一yl】-2，5一diphenyltetrazoliumbromide)溶液(5mg／ml，Sigma，USA)繼續(xù)培養(yǎng)4hr，吸去上清液，加入150ulDMSO(Sigma，USA)，振蕩10min，490nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細(xì)胞生長曲線。集落形成實驗在干擾48小時后接種400個細(xì)胞于6em培養(yǎng)皿中2

8、周后用蘇木素染色．8、數(shù)據(jù)分析采用SP