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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文J亞群禽白血病病毒gp85基因的克隆表達(dá)及初步應(yīng)用姓名：劉麗娜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：栗紹文；羅青平201206J亞群禽白血病病毒gp85基因的克隆表達(dá)及初步應(yīng)用摘要禽白血病(Avianleukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤。J亞群禽白血病病毒(AI肛J)是90年代初期分離并鑒定的一個(gè)新的亞群，其傳播性和致病性都比其他亞群強(qiáng)，可引起雞的髓細(xì)胞瘤，給全球養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，國(guó)內(nèi)
2、部分省市出現(xiàn)大規(guī)模的禽白血病感染病例，主要以J亞群病毒感染為主。病毒的gp85基因是J亞群區(qū)別其它亞群的特異性序列。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ALV-Jgp85蛋白，建立J亞群禽白血病ELISA抗體檢測(cè)方法，利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備抗gp85蛋白的單克隆抗體。為我國(guó)J亞群禽白血病的血清監(jiān)測(cè)和抗原診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：(1)根據(jù)GeneBank中ALV-J的gp85基因序列設(shè)計(jì)針對(duì)J亞群病毒的特異性引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的ALV-JXT0908毒株為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段，測(cè)序結(jié)果顯示
3、gp85基因片段與GeneBank中部分ALV-J核苷酸序列同源性在93．6％．98．2％。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)．gp85，表達(dá)目的蛋白，使用His．鎳親和層析柱進(jìn)行純化。(2)用gp85蛋白作為包被抗原，建立J亞群禽白血病ELISA抗體檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明該檢測(cè)方法重復(fù)性良好，與禽源的幾種病毒和細(xì)菌陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)，并利用建立的ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，與IDEXX公司生產(chǎn)的抗體檢測(cè)試劑盒符合率達(dá)到96．29％。。(3)用gp85蛋白免疫Balb／C小鼠，將SP
4、2／0骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞進(jìn)行融合，陽(yáng)性孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，并對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔制各腹水。用辛酸．硫酸銨沉淀法對(duì)腹水進(jìn)行純化。結(jié)果表明，獲得5株雜交瘤細(xì)胞：1G4、189、3A1、3D12、5G5。雜交瘤細(xì)胞上清抗體效價(jià)均在27以上，腹水抗體效價(jià)均在100x27以上，染色體數(shù)目均在79．93之間。Western-blotting鑒定結(jié)果表明，5株單克隆抗體均可以與gp85蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。關(guān)鍵詞：J亞群禽白血??；gp85蛋白；間接ELISA方法；單克隆抗體華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆
5、碩士研究生學(xué)位論文AbstractAvianleukosis(AL)isageneraldesignationofavarietyofavianneoplasticdiseases，whichiscausedbyavianleukosisvirus(ALV)．AvianLeukosisVirussubgroupJ(ALV-J)frombroilersWasidentifiedasanewsubgroupin1991．Itsepidemicandpathogenicityarestrongerthanothersubg
6、roups，whichCallcausemyeloidleukosis(ML)andenormouseconomiclossestotheglobalcultvafion．Recentyears，ALV—JcausedepidemicinseveralprovincesandcitiesinChina．gp85geneisthespecificnucleotidesequenceofALV-J．Inthisstudy，recombinantgp95proteinWaspmkaryoticlyexpressedinE．
7、coliandanindirectELISAfordetectingtheantibodyofALV-JWasestablished．Andthemonoelonalantibodiesagainstgp85proteinweredeveloppedbyhybridomacellfusiontechnology．ThestudyprovidedthebasisforserummonitoringofALV-Janddevelopmentofanfigendiagnostickits．Theresultsweresho
8、wedasfollows：(1)Accordingtothegp85geneofALV-JstrainspublishedbyGeneBank,apairofspecificprimersWasdesigned．TheALV-JstrainXT0908wasusedastemplate，andthegp85genewasamplifiedbyR
