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《a和b亞群禽白血病病毒gp85基因的表達(dá)及其抗血清的亞群特異性比較》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文A和B亞群禽白血病病毒gp85基因的表達(dá)及其抗血清的亞群特異性比較姓名：王麗申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)指導(dǎo)教師：崔治中20120615山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文。中文摘要為制備相應(yīng)的特異性抗體用于快速分離鑒定～『B亞群的ALV，本實(shí)驗分別克隆表達(dá)了A亞群禽白血病病毒(AL、，-A)SDAU09Cl株和B亞群禽白血病病毒(ALv-B)SDAU09C2株的囊膜gp85基因，嘗試應(yīng)用gp85基因的表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔來獲取大量高效價的特異抗血清。根據(jù)已發(fā)表A亞群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亞群禽白血病病毒(
2、ALv-B)SDAU09C2株基因序列，利用pIIimer5．O設(shè)計并合成一對引物。利用PCR方法擴(kuò)增兩毒株的囊膜gp85基因片段，將目的片段克隆至pMDl8．T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL2l(DH50【)，構(gòu)建重組載體。經(jīng)核酸序列測定，克隆的基因片段分別長1017bp，1038bp，為gp85基因開放性讀碼框的全長序列，分別編碼339，346個氨基酸。將gp85基因片段分別連接至pET-32a(+)表達(dá)載體中，經(jīng)抗性篩選、PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶分析，篩選獲得目的片段正向插入、有正確讀碼框的陽性克隆，分別命名為pET．SDAU09C1一gp85
3、和pET-SDAU09C2一gp85。陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E∞肛BL21(Rosetta)宿主菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS．PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)。通過誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，確立了最佳的誘導(dǎo)條件為30℃，lmMIPTG濃度，誘導(dǎo)表達(dá)5h。因融合蛋白氨基端含有6個組氨酸，用鎳金屬親和層析純化目的蛋白。取A亞群禽白血病病毒(ALv-A)SDAU09Cl株和B亞群禽白血病病毒(ALv-B)SDAU09C2株的陽性雞血清分別進(jìn)行wbstemblotting檢測，結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白是特異性的。將純化的融合蛋白按常規(guī)方法免疫家兔，三免后
4、一周，心臟采血分離血清。取兩種抗血清進(jìn)行間接免疫熒光反應(yīng)(IFA)測定效價，效價均可達(dá)l：500，其中SDAU09C1抗血清在1：100稀釋時效果較好，而SDAU09C2抗血清在1：50稀釋時效果較好。取抗血清最佳稀釋度與本實(shí)驗室保存的A亞群禽白血病病毒SDAU09E1株，SDAU09C3株，和J亞群禽白血病病毒HN0001株進(jìn)行IFA區(qū)分鑒定。結(jié)果不論是A亞群SDAU09C1血清還是B亞群SDAU09C2血清都能與A或B亞群的不同毒株發(fā)生陽性反應(yīng)，但效價不同。然而，二種血清都不與J亞群韻Nx0101株發(fā)生反應(yīng)。用制備的兩種抗血清，采用固定病毒
5、(200TCID50)稀釋血清的方法進(jìn)行交叉中和反應(yīng)。結(jié)果顯示，抗SDAU09Cl株gp85產(chǎn)生的兔血清的抗體效價比較高，對兩個分離株都有較高的中和效價。而且對SDAU09C2株的中和效價甚至高于SDAU09C2株抗血清對自身病毒的中和值，但每一種血清對自身病毒的中和值都明顯高于對異源病毒的中A和B亞群禽白血病病毒gp85基因的表達(dá)及其抗血清的亞群特異性比較和值。為此，本實(shí)驗計算和分析了二株病毒間抗原性相關(guān)系數(shù)r值，結(jié)果顯示SDAU09C1株與SDAU09C2株在病毒交叉中和反應(yīng)中的r值為36．6％。關(guān)鍵詞：禽白血病病毒；重組gp85；兔抗gp
6、85血清；病毒交叉中和反應(yīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文ABSTRACTInordertogetarapidspecificdiagIlosticreagentforsubgroupA／BAViallLeul(osisVimsdetectionandcomparetheantigenicrelatedllessofa11ti-gp85serumofChineses缸缸nSDAU09C1ofsubgroupAaViallleul【osisVimses鋤dSDAU09C2ofsubgroupBaVianleukosisVimses．Therecombin
7、aultgp85proteinhadbeenexpressedaIldaIlti—senunwausmadebyinununizingrabbitswitllpurifiedgp85protein．．EnV—gp85geneⅥ粥amplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)、Ⅳithapairof州mersdesignedaccordingtotllepubliShedgp85genesequence矗omplaSmidsreSpectiVelycontainingt11eenvgeneofChineses仃ai
8、llSDAU09ClofsubgroupAaViallleuI(osisVirusesandSDAU09C2ofsub筍oupBaviaIllelll
