致急性纖維肉瘤的缺陷型j亞群禽白血病病毒腫瘤基因的鑒定

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1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文致急性纖維肉瘤的缺陷型J亞群禽白血病病毒腫瘤基因的鑒定姓名：陳浩申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：崔治中20120615山東農(nóng)業(yè)人學(xué)博一l：學(xué)位論文中文摘要根據(jù)致瘤機(jī)制的不同，禽白血?。饬霾《救焊鞒蓡T病毒被劃分慢性轉(zhuǎn)化型病毒和急性轉(zhuǎn)化型病毒兩類。慢性轉(zhuǎn)化型病毒通過插入啟動(dòng)機(jī)制間接激活細(xì)胞原癌基因(c．onc)而引發(fā)腫瘤，潛伏期較長(zhǎng)，一般超過90天；而急性轉(zhuǎn)化型病毒則是通過直接啟動(dòng)自身基因組中攜帶的病毒腫瘤基因(v．onc)而導(dǎo)致急性腫瘤的形成，潛伏期一般僅在數(shù)周之內(nèi)(FadlyandNair，2008

2、)。禽ALV．J的原型毒株HPRS．103是一種復(fù)制完整型病毒，其基因組中不含有任何病毒致瘤基因，在機(jī)體內(nèi)不能快速誘發(fā)腫瘤的形成，在體外也不能轉(zhuǎn)化雞骨髓細(xì)胞(Payneeta1．，1992)。而在1993年，Payne等從該株病毒感染的表現(xiàn)有髓細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)室病雞中分離到了數(shù)株攜帶有腫瘤基因v-myc的急性轉(zhuǎn)化型病毒，這些病毒大多可以轉(zhuǎn)化體外的骨髓細(xì)胞，在雞體上可導(dǎo)致多種急性腫瘤的發(fā)生，如髓細(xì)胞瘤、腎胚細(xì)胞瘤及腎腺瘤等。而其中的966株則得到了較為詳盡的研究(Payneeta1．，1993)。2000年，Venugopal等從自然感染J亞

3、群病毒的患有成紅細(xì)胞性白血病的雞群中分離到若干株含1，．myc的急性病毒，它們不僅可以誘發(fā)急性成紅細(xì)胞增多病，而且還能導(dǎo)致髓細(xì)胞瘤和其他腫瘤的形成(Venugopaleta1．，2000)。Fujinami肉瘤病毒(FSV)于1914年從日本分離出來(Fujinarniandlnamoto，1914)，起初曾認(rèn)為它和帶有v-src腫瘤基因的勞斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus，RSV)是同一病毒的不同毒株，后來經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)它是完全不同的另一種帶有v-fps腫瘤基因的急性缺陷型病毒(ShibuyaandHanafusa，198

4、2)。此外，PRCII是一株從自然發(fā)病雞中分離的在5'-fps端缺失1020個(gè)核苷酸的此類型毒株，它轉(zhuǎn)化細(xì)胞能力及致腫瘤能力稍弱(Carlbergela1．，1984；Huangeta1．，1984)。近年來，我們發(fā)現(xiàn)在國(guó)內(nèi)爆發(fā)該病的雞群中出現(xiàn)了急性肉瘤病例，病例組織切片法●檢測(cè)表明其為典型纖維肉瘤，通過病毒分離試驗(yàn)確定病料中含有ALv．J(劉紹瓊等，2011)。肉瘤組織研磨濾過液及其接種過的第一代DF細(xì)胞上清，在接種1日齡SPF雞和817肉雜雞后，可以在9天內(nèi)復(fù)制出相同的纖維肉瘤(李傳龍等，2012)。因此，我們懷疑其中除了含有完整復(fù)

5、制型的ALv-J外，很可能還存在一種可以引發(fā)快速致瘤的攜有某種病毒腫瘤基因(v．onc)的缺陷型病毒。敏急性纖維肉癰的缺陷型J驅(qū)群禽[J血病病毒腫瘤基因的鑒定本研究課題初步探究了缺陷型病毒在體外CEF細(xì)胞培養(yǎng)中的生物學(xué)活性：提取病料中的病毒RNA和前病毒DNA，使用PCR法篩選到相關(guān)v．011c；然后制備針對(duì)該基因所編碼蛋白的特異性抗血清，建立免疫熒光方法、免疫組化法分別對(duì)感染細(xì)胞中的病毒抗原、肉瘤組織切片進(jìn)行檢測(cè)：構(gòu)建含有該腫瘤基因的缺陷型病毒的全基因組質(zhì)粒，拯救分子克隆化病毒，回歸動(dòng)物復(fù)制病征，從而在分子和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平上佐證缺陷型

6、病毒是造成急性纖維肉瘤的主因。為了觀察肉瘤病料中缺陷型病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖能力，分別將肉瘤組織濾過液及其感染后的細(xì)胞第1代毒、第2代毒接種相同的三組試驗(yàn)雞只，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第l代細(xì)胞毒同肉瘤研磨液具有相似的致瘤能力，但第3代細(xì)胞毒的致瘤速度及誘發(fā)雞只出現(xiàn)腫瘤的比例則明顯下降，這表明肉瘤中存在的缺陷型病毒粒子在體外CEF細(xì)胞培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生的子代病毒粒子會(huì)逐漸減少，結(jié)合其不能引起CEF出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)的現(xiàn)象，我們推測(cè)該類缺陷型病毒很可能不適應(yīng)在CEF上生長(zhǎng)。使用PCR方法，我們擴(kuò)增到了復(fù)制完整型ALV-J病毒粒子的完整基因組(命名為SDl

7、005)，同國(guó)內(nèi)外其他12個(gè)J亞群毒株比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與引發(fā)慢性髓細(xì)胞瘤和血管瘤的毒株JS09GY6(Wueta1．，2010)具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，且整體核酸同源性高達(dá)97％，與其它毒株相比，亦沒有顯著的基因缺失或突變。而且，其基因組結(jié)構(gòu)中并不含有任何病毒腫瘤基因，與J亞群病毒原型株HPRS一103同屬于完整復(fù)制型病毒，再結(jié)合禽白血?。饬霾《局铝鰴C(jī)制(FadlyandNair，2008)，可以排除SDl005是導(dǎo)致這種急性腫瘤形成的原因。隨后，使用多對(duì)擴(kuò)增不同腫瘤基因嵌合體分子的引物，我們確定了數(shù)個(gè)含有v-fps腫瘤基因的缺陷型基因組(

8、Fu．Jl-5)，其結(jié)構(gòu)特征為：5’-R·U5一／xgag-fps．Ae?lv．U3．R．3’或5’一R—U5一Agag-fps—Ap01．／Xenv-U3一R-3’。在etlv基因水平上，F(xiàn)u-Js同SD