海水養(yǎng)殖中常見病原菌凍干保護(hù)劑配方與凍干工藝研究

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1、分類號(hào)——————————————————————密級(jí)UDC研究生學(xué)位論文海水養(yǎng)殖中常見病原菌凍干保護(hù)劑配方與凍干工藝研究研究生姓名于永翔指導(dǎo)教師姓名戰(zhàn)文斌教授王印庚研究員申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱水生生物學(xué)論文答辯日期2014年5月30日學(xué)位授予日期2014年6月中國海洋大學(xué)萬方數(shù)據(jù)僅以此文獻(xiàn)給養(yǎng)育我的父母和尊敬的導(dǎo)師以及關(guān)心、支持和幫助我的朋友們-------于永翔萬方數(shù)據(jù)海水養(yǎng)殖中常見病原菌凍干保護(hù)劑配方與凍干工藝研究學(xué)位論文答辯日期：年月日指導(dǎo)教師簽字：答辯委員會(huì)成員簽字：萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文

2、中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含未獲得（注：如沒有其他需要特別聲明的，本欄可空）或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日--------------------------------------------------------------------學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)學(xué)?？梢?/p>

3、將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽字：簽字日期：年月日簽字日期：年月日萬方數(shù)據(jù)海水養(yǎng)殖中常見病原菌凍干保護(hù)劑配方與凍干工藝研究摘要長(zhǎng)期保存海水養(yǎng)殖病原菌的活性是深入進(jìn)行其病原學(xué)研究的重要前提和保障。真空冷凍干燥技術(shù)是目前情況下制備和保藏生物材料最有效的方法之一。本文初步探討了真空冷凍干燥技術(shù)在5株海水養(yǎng)殖重要致病菌菌種保藏中的應(yīng)用，相關(guān)的研究成果

4、將為海洋細(xì)菌真空冷凍干燥工藝研究提供重要的參考和借鑒。1.病原微生物冷凍干燥保護(hù)劑的篩選實(shí)驗(yàn)選取遲鈍愛德華氏菌、假交替單胞菌、哈維氏弧菌、燦爛弧菌、鰻弧菌等5株3屬的病原細(xì)菌為實(shí)驗(yàn)菌株，以不同濃度的脫脂乳、海藻糖、甘露醇、乳糖、果糖、葡萄糖、抗壞血酸和明膠等八種物質(zhì)作為凍干保護(hù)劑，以添加等體積1.50%氯化鈉溶液為對(duì)照。結(jié)果表明：以不同濃度的抗壞血酸和明膠為凍干保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)組中均未檢測(cè)到活菌的存在；與對(duì)照組相比，一定濃度的脫脂乳和糖類均可在冷凍干燥過程中對(duì)病原菌起到保護(hù)作用，各保護(hù)劑對(duì)菌株的凍干保護(hù)效果由強(qiáng)到弱依次為：假交替單胞菌：脫脂乳，麥芽糖，海藻糖，乳糖，甘露醇，葡萄糖，果糖；

5、遲鈍愛德華菌：脫脂乳，乳糖，甘露醇，海藻糖，麥芽糖，葡萄糖，果糖；哈維氏弧菌：甘露醇，海藻糖，乳糖，麥芽糖，果糖，脫脂乳，葡萄糖；鰻弧菌：乳糖，甘露醇，脫脂乳，麥芽糖，海藻糖，葡萄糖，果糖；燦爛弧菌：甘露醇，乳糖，脫脂乳，海藻糖。2.冷凍干燥保護(hù)劑配伍優(yōu)化根據(jù)單因素篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本章選取脫脂乳、乳糖、海藻糖和甘露醇為凍干保護(hù)劑，同時(shí)添加了一定量的抗壞血酸作為抗氧化劑，明膠作為賦形劑來進(jìn)行保護(hù)劑的正交復(fù)配實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，假交替單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和哈維氏弧菌通過正交分析得到了最佳的保護(hù)劑配比，并且通過三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可證明復(fù)配保護(hù)劑的穩(wěn)定性較好。其中假交替單胞菌的最佳保護(hù)劑配比和對(duì)

6、應(yīng)的細(xì)胞存活率為：乳糖7.5%、甘露醇5%、海藻糖5%、脫脂乳10%、Vc0.5%、明膠0.5%，3次重復(fù)檢驗(yàn)細(xì)胞存活率均大于32.17%；遲鈍愛德華氏菌為：5%的乳糖、15%I萬方數(shù)據(jù)的脫脂乳、0.5%明膠、0.5%的Vc，3次驗(yàn)證后保護(hù)劑的穩(wěn)定性較好，細(xì)胞存活率在20.0%左右。哈維氏弧菌的最佳保護(hù)劑配比為：7.5%的乳糖、5%的甘露醇、5%的海藻糖、15%的脫脂乳、0.5%的明膠和0.5%的Vc，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存活率均在5.0%左右。鰻弧菌和燦爛弧菌因凍干后的細(xì)胞復(fù)活率極低，各正交實(shí)驗(yàn)組之間差異不明顯，未獲得保護(hù)效果明顯的保護(hù)劑配比。上述結(jié)果表明弧菌類的菌株與假交替單胞菌和遲鈍

7、愛德華氏菌相比，其凍干保護(hù)效果較差。3.真空冷凍干燥條件與工藝優(yōu)化以假交替單胞菌為代表菌株，以經(jīng)復(fù)配并驗(yàn)證的假交替單胞菌復(fù)配保護(hù)劑為凍干保護(hù)劑，主要對(duì)凍干保存過程中保護(hù)劑含鹽量，復(fù)水介質(zhì)，初始細(xì)菌濃度，保護(hù)劑與菌液的比例，細(xì)菌生長(zhǎng)階段等工藝條件進(jìn)行探討。結(jié)果表明：當(dāng)以1.5%NaCl溶液制備菌懸液時(shí)，保護(hù)劑的最佳含鹽量為0.5%，此時(shí)細(xì)菌的存活率9為40.3%；初始細(xì)胞濃度的最適范圍在1-5×10CFU/ml之間，細(xì)胞濃度過高或過低都會(huì)降低細(xì)胞存活率；5-