清熱益氣通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞保護(hù)作用的研究

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1、成都中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文成都中醫(yī)藥大學(xué)二0一四屆博士研究生學(xué)位論文清熱益氣通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞保護(hù)作用的研究ProtectiveEffectsofQingreYiqiTongluoFangonPodocyteInjuryinratswithDiabeticKidneyDisease研究生姓名：朱?；壑笇?dǎo)教師：葉學(xué)鋒學(xué)科專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合臨床二○一四年五月1萬方數(shù)據(jù)成都中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文學(xué)位論文清熱益氣通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞保護(hù)作用的研究朱海慧指導(dǎo)教師姓名：葉學(xué)鋒申請學(xué)位級別：博士專業(yè)名稱：中西醫(yī)結(jié)合臨床

2、論文提交時(shí)間：2014-5-6論文答辯時(shí)間：2014-5-21二○一四年五月2萬方數(shù)據(jù)成都中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要目的：研究清熱益氣通絡(luò)方對實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷的治療作用及其機(jī)制。方法：采用單側(cè)腎切除鏈脲佐菌素腹腔注射方法制備糖尿病腎病大鼠模型。將糖尿病腎病大鼠的分為3組：模型組（n=10）、中藥組（n=9）、厄貝沙坦組（n=8），另設(shè)正常對照組（n=10）。連續(xù)治療12周，觀察各組大鼠：①腎/體重指數(shù)、24h微量白蛋白量、24h尿蛋白量、血肌酐、尿素氮。②光鏡及透射電鏡觀察分析腎組織病理形態(tài)變化，測量腎

3、小球橫截面積、系膜區(qū)面積、系膜區(qū)面積/腎小球橫截面積比值、腎小球基底膜厚度、足突平均寬度、足突融合率；③免疫組化法對腎小球足細(xì)胞表面特異性蛋白podocalyxin、P鈣黏蛋白(P-cadherin)、結(jié)蛋白（desmin）、成纖維細(xì)胞特異蛋白1(FSP1)進(jìn)行染色標(biāo)記，免疫熒光雙標(biāo)記podocalyxin/desmin、P-cadherin/FSP1，觀察兩組共表達(dá)情況及表達(dá)強(qiáng)度；④免疫熒光標(biāo)記足細(xì)胞腎胚胎瘤抑制基因(WT1)，計(jì)數(shù)WT1陽性足細(xì)胞數(shù)及密度；⑤酶聯(lián)免疫吸附法檢測腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧歧化酶、過氧化氫酶、

4、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽、丙二醛含量。結(jié)果：①模型組大鼠腎/體重指數(shù)、24h尿蛋白、24h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮顯著高于正常組（P<0.01）；中藥組大鼠以上指標(biāo)均顯著低于模型組大鼠（P<0.01或P<0.05），中藥組24h尿蛋白量顯著低于厄貝沙坦組大鼠（P<0.05）。②模型組大鼠腎小球橫截面積、系膜區(qū)、足突寬度、足突融合率及基底膜厚度均高于正常組大鼠（P<0.01或P<0.05）；中藥組大鼠球橫截面積、系膜區(qū)、足突寬度、足突融合率及基底膜厚度與模型組比明顯較低（P<0.01或P<0.05），中藥組M

5、A明顯較低（P<0.05）；中藥組大鼠足突融合率低于厄貝沙坦組大鼠（P<0.05）。③免疫熒光雙標(biāo)記染色顯示，正常組大鼠腎小球內(nèi)未見有兩組蛋白抗體共同標(biāo)記染色，糖尿病腎病大鼠出現(xiàn)大量兩組蛋白抗體共同標(biāo)記染色現(xiàn)象；DKD大鼠腎小球podocalyxin、P-cadherin表達(dá)強(qiáng)度顯著低于正常組（P<0.01），F(xiàn)SP1、Desmin表達(dá)強(qiáng)度高于正常組（P<0.01）；與模型組比，中藥組腎小球podocalyxin、P-cadherin表達(dá)強(qiáng)度顯著較高（P<0.01或P<0.05），F(xiàn)SP1、Desmin表達(dá)強(qiáng)度明顯較低（

6、P<0.01或P<0.05）；與厄貝沙坦組比，中藥組podocalyxin表達(dá)強(qiáng)度較高、FSP1表達(dá)強(qiáng)度較低3萬方數(shù)據(jù)成都中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文（P<0.05）。④與正常組比，糖尿病腎病大鼠腎小球WT1陽性足細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯減少（P>0.05），腎小球內(nèi)足細(xì)胞密度較小(P<0.01)；中藥組足細(xì)胞密度顯著大于模型組（P<0.01）。⑤與正常組相比，模型組大鼠丙二醛含量較高(P<0.01)，還原型谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧歧化酶、過氧化氫酶水平較低(P<0.01)；與模型組比，中藥組大鼠腎皮質(zhì)丙二醛含量較少（P<0.

7、01），還原型谷胱甘肽、超氧歧化酶、過氧化氫酶水平較高（P<0.01或P<0.05）；中藥組大鼠腎皮質(zhì)超氧歧化酶、過氧化氫酶高于厄貝沙坦組大鼠（P<0.05）。結(jié)論：①清熱益氣通絡(luò)方藥能降低糖尿病腎病大鼠24h尿微量白蛋白、24h尿蛋白排泄及血肌酐、尿素氮，能減輕DKD大鼠腎小球病理損害。②該實(shí)驗(yàn)時(shí)限內(nèi)糖尿病腎病大鼠腎臟足細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯減少，足細(xì)胞密度降低，足細(xì)胞表型發(fā)生變化（podocalyxin、P-cadherin表達(dá)強(qiáng)度減弱，F(xiàn)SP1、Desmin表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)），清熱益氣通絡(luò)方藥能減輕這一變化；③清熱益氣通絡(luò)方藥

8、能提高DKD大鼠腎組織抗氧化物質(zhì)SOD、CAT、GSH含量，減少M(fèi)DA，減輕局部氧化應(yīng)激損傷。這種作用至少是其拮抗足細(xì)胞表型改變的部分機(jī)制。④清熱益氣通絡(luò)方藥保護(hù)足細(xì)胞作用是其治療DKD大鼠蛋白尿的重要作用靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞：糖尿病腎??；清熱益氣通絡(luò)方；足細(xì)胞表面特異性蛋白；P鈣黏蛋白；結(jié)蛋白；成纖維細(xì)胞特異蛋白；腎胚胎瘤