基于丙谷二肽的酶促合成研究

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1、天津大學(xué)碩士學(xué)位論文丙谷二肽的酶促合成研究姓名：于清新申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：化學(xué)工程指導(dǎo)教師：何志敏201006中文摘要本文以重要的腸外營(yíng)養(yǎng)用藥——丙谷二肽的酶法制備為核心內(nèi)容，設(shè)計(jì)完成了包括引入保護(hù)基、催化肽鍵合成、脫保護(hù)基三步構(gòu)成的完整合成工藝路線，并對(duì)主要酶促合成工藝條件進(jìn)行了分析優(yōu)化；在此基礎(chǔ)上，引入CLEA技術(shù)，對(duì)合成中涉及的兩種重要酶制劑——木瓜蛋白酶和青霉素G?；高M(jìn)行新型固定化酶技術(shù)開發(fā)，優(yōu)化制備條件，考察催化性質(zhì)，表征形貌結(jié)構(gòu)：同時(shí)，開展CLEA微囊化方法的探索研究，為丙谷二肽的高收率、低成本制備提供有益參考，主要研究結(jié)果如下：酶促合

2、成丙谷二肽：以木瓜蛋白酶和青霉素G?；笧橹饕磻?yīng)用酶，成功制得丙谷二肽；全套反應(yīng)由引入保護(hù)基、木瓜蛋白酶酶促肽鍵合成和青霉素G酰化酶催化脫保護(hù)三步構(gòu)成，各步反應(yīng)收率最終為86．41％，30．5％和94．8％，總收率為24．98％。；合成過程中，采用HPLC-MS、核磁等手段對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)鑒定；同時(shí)，開發(fā)了以制備色譜為主的目標(biāo)物分離提純方法。木瓜蛋白酶催化ph觚．舢a(chǎn)．Gln的合成：反應(yīng)由動(dòng)力學(xué)控制，通過優(yōu)化工藝條件，得出在pH8．8，25℃，助溶劑乙醇添加量為1．5mL，游離酶濃度O．02g／mL，GlIl濃度O．5mo兒，Pllac．ma旬Me濃度0

3、．05mo兒，添加KCI濃度為O．1mo兒，反應(yīng)160I血情況下，合成苯乙?；Ｗo(hù)的丙谷二肽收率最高，可達(dá)30．5％；將木瓜蛋白酶CLEA應(yīng)用于反應(yīng)，15h時(shí)收率為9．32％：針對(duì)CLEA技術(shù)應(yīng)用中存在的顆粒較小，不利于工業(yè)化應(yīng)用的問題，提出囊化解決方案，制得6種木瓜蛋白酶CLEA微囊，對(duì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行表征，其中實(shí)心海藻酸鈣微囊酶活保留最高，達(dá)53．42％。青霉素G?；复呋摫Ｗo(hù)基生成舢a(chǎn)．Gln：將青霉素G?；赣坞x酶應(yīng)用于A1aGhl的合成，反應(yīng)0．33h，悼達(dá)94．8％；制備得到青霉素G酰化酶CLEA，優(yōu)化條件為：飽和硫酸銨溶液為沉淀劑，與酶液體積

4、比為2．3：l時(shí)為最適用量，戊二醛為交聯(lián)劑，濃度0．35％，交聯(lián)時(shí)間為2h，溫度4℃，最終酶活保留可達(dá)52．61％；所得CLEA的最適溫度與游離酶相比提高了10℃，因此可以在較高溫度下應(yīng)用；最適pH與游離酶相比向堿性偏移了兩個(gè)單位，適用范圍拓寬：熱失活研究表明，高溫下青霉素G酰化酶CLEA的熱穩(wěn)定性比游離酶明顯提高，反應(yīng)1．0h，收率為95．6％：實(shí)驗(yàn)制得兩種青霉素G酰化酶CLEA微囊，其中中空微囊酶活保留可達(dá)16．84‰機(jī)械強(qiáng)度最高可達(dá)7．95N：將青霉素G酰化酶CLEA微囊應(yīng)用于反應(yīng)，2．2h時(shí)，收率為95．2％。關(guān)鍵詞：丙谷二肽、酶促肽合成、cLE

5、A、cLEA微囊ABSTRACTInt11ispaper，eIlzymatics)，Iltllesisof砧a．Gln砌chisaniInponantabentericnutritiousdmgwasconsiderdastllecoreof廿leresearch．ThesyntheticroutemcludmgproteCtioIl，enzymatic拶nthesisofdepeptideanddeprotectionwasSuccessmllydeVeloped．0ntllatbasis，CLEAtechnologywasappliedtothepa

6、paillandPG氣bothofthemarekeyeI珂mesiIlsyntlletiziIlg燦a如lILTheconditionsofpreparingCLEAWIereoptiIIlized，thepropeniesofCLEA、ⅣerestudiedaJldthe咖c仃ueofCLEAwasalsoc11amCterized．F0r$nthesiZiIlgAlaGln誦th11i曲yieldand】owcost，CLEAmicfocapsules11aVealsobeenexploreda11dStudied．Theconclusionsca

7、nbedmwnasfbllows：EⅡ巧maticsynthesisof舢a(chǎn)-Gh：Ala如ln吼ssuccessmllysymhesizedbyusingpapain觚dPGA．ThereactionscanbediVidediIno3st印si11cludiIlgprotectioIl’peptidesyntllesisbypapain觚duIlprotectionbyPGA．Theyieldsofthe3Steps眥e86．41％，30．5％鋤d94．8％respectively．The丘mlyieldwas24．98％．HPLC-MSandNMR

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