α—半乳糖苷酶發(fā)酵工藝、分離純化及其應(yīng)用研究

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1、浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院博士學(xué)位論文α—半乳糖苷酶發(fā)酵工藝、分離純化及其應(yīng)用研究姓名：劉彩琴申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：食品科學(xué)指導(dǎo)教師：何國(guó)慶20070401逝些厶堂擅主翌位迨窒蟲(chóng)室摘要量為107．9KDa。純化后0【．半乳糖苷酶的三組分最適作用溫度均為60℃；(]L一半乳糖苷酶三組分的最適作用pH不同，n—galI和d—galIII的最適反應(yīng)pH為5．0，Ⅱ．gaIⅡ?yàn)?．0；就酸堿穩(wěn)定性而言，cc_galI在pH4．0的環(huán)境中最穩(wěn)定(酶活保留率達(dá)78．9％)，0L—galII在pH6．0的

2、環(huán)境中最穩(wěn)定(酶活保留率達(dá)73．7％)，0【．gal111在pH5．0的環(huán)境中最穩(wěn)定(酶活保留率達(dá)88．4％)。(6)不同金屬離子和糖類(lèi)等對(duì)0【．半乳糖苷酶三組分酶活的影響是不同的：三組分均受A礦強(qiáng)烈抑制，Cu2+對(duì)d—galI和0【-g甜III有明顯的抑制作用，而對(duì)僅一galII有激活作用。ca2’、M92+、K+和Na+對(duì)0【-galI酶活的影響不大，Mn2+離子有激活作用；Ca2+、M92中、Zn2+和Mn2+對(duì)旺-galII有激活作用，e和Na+有抑制作用：Ca2+、Zn¨和K+對(duì)a．galI

3、II酶活的影響不大，Mg”、Mn2+和Na+離子有激活作用。SDS對(duì)a一半乳糖苛酶a唱alI和d-galIII有明顯的抑制作用，而對(duì)q．galII影響較小，EDTA、乳糖、棉籽糖對(duì)三組分均有抑制作用，海藻糖、甘露糖、CaCl·2H20和巰基乙醇對(duì)a-galI和0【一galII均有抑制作用，而對(duì)d—galTII組分幾乎無(wú)影響。(7)ol—galI對(duì)對(duì)硝基．旺一D一半乳糖苷的米氏常數(shù)Km=9．39mmol／L，對(duì)水蘇糖的Km=12．79mmol／L，對(duì)棉籽糖的Krn=4．79mmol／L，對(duì)蜜二糖的Km=

4、1．03mmol／L；c【．galII對(duì)對(duì)硝基一n—D-半乳糖營(yíng)的米氏常數(shù)Kin=6．54mmol／L，對(duì)水蘇糖的Km=2．39mmol／L，對(duì)棉籽糖的Km=11．38mmol／L，對(duì)蜜二糖的Km=2．02mmol／L；c【．gallII肘對(duì)硝基．Ⅱ．D一半乳糖苷的米氏常數(shù)Krn=8．24mmol／L，對(duì)水蘇糖的Km=9．98mmol／L，對(duì)棉籽糖的Km=4．33mmol／L，對(duì)蜜二糖的Kin=3．18mmol／L。(8)甘露醇、海藻糖和棉籽糖對(duì)c【一半乳糖苷酶粗酶液熱穩(wěn)定性有較好的保護(hù)作用。采用『F

5、交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得了復(fù)合保護(hù)劑配方為：1．75mmol／L的海藻糖，1．5mmol／L的甘露醇和2mmol／L的棉籽糖。復(fù)合保護(hù)劑的添加能使a．半乳糖苷酶在30℃～60。C范圍內(nèi)的酶活保留率提高11．6％～21．7％，28。C存放24h，該酶在試{3．0的環(huán)境中保健d52％的活性。u一半乳糖苷酶在28℃、36．2℃和45℃下貯存，酶活損失50％的時(shí)間分別為：液體酶對(duì)照組51．90、28．13和7．31天；液體酶處理組：97．11、40．685n7．49天，而固體a．半乳糖苷酶損失50％所需時(shí)間分別為：88

6、．54、24．475L18．78天。(9)純化后的Ⅱ-半乳糖苷酶0【一galI、“一galII和0【一galIⅡ均能水解豆粕乳、棉籽粕乳和菜籽粕乳中的水蘇糖、棉籽糖等寡糖。a—galI、0【一galII和c【一galIII均能水解豆粕乳中水蘇糖和棉籽糖。旺一galII對(duì)水蘇糖的水解能力大于旺一galI和n—galIII，50。C比40。C更易使豆粕乳中水蘇糖游離出。40。C和50。C水浴溫度下，反應(yīng)1～5h，cl—galII對(duì)豆粕乳中棉籽糖的水解率達(dá)100％；n—galI和a—galIII對(duì)棉籽糖的水

7、解能力較弱，50。C比40。C更有利于棉籽糖的生成。cc—galI、旺一galII和a-galⅢ對(duì)棉籽粕乳具有水解作用。Ⅱ-galII對(duì)水蘇糖的水解能力比VI逝迤厶堂壤±堂位絲毫——蟲(chóng)噩擅耍cl-galI、cc-galIII高。c【嘻a111對(duì)棉籽糖的水解能力最強(qiáng)，40。C時(shí)反應(yīng)3h，水解率達(dá)99．9％。其次是c【一galIII，其對(duì)棉籽糖的水解率在40。C時(shí)以3h最高，為43．3％，50℃時(shí)4h最高，為84．71％。0t-gaII對(duì)棉籽糖的水解能力較弱。Ⅱ一galI、o【一galII和0【一galI

8、Ⅱ?qū)Σ俗哑扇橛兴庾饔?。其中，?galIⅡ?qū)λK糖的水解能力最強(qiáng)；在40℃和50。C水浴溫度下，水蘇糖的水解率為100％。40。C時(shí)，u．galH作用3h，而50。C作用2h，水蘇糖完全被酶解；u—galI對(duì)水蘇糖的水解能力較弱，與50℃相比，40。C更不利于水解。40。C時(shí)，0l嚕alI作用1h，可將棉籽糖幾乎完全水解：而0【一galIl和仳一gal111對(duì)棉籽糖的水解能力弱。50。C時(shí)，三者對(duì)棉籽糖的水解能力均很弱。(10)固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的旺一半乳