《凝膠電泳技術(shù)》PPT課件

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1、凝膠電泳技術(shù)電泳（electroghoresis）：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對(duì)流都比較強(qiáng)，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程，減少了擴(kuò)散和對(duì)流等干擾作用。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進(jìn)了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯

2、酰胺凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。電泳的基本原理：在電場(chǎng)中，推動(dòng)帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力（F）等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量（Q）與電場(chǎng)強(qiáng)度（E）的乘積。F＝QE質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對(duì)于一個(gè)球形質(zhì)點(diǎn)，服從Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r為質(zhì)點(diǎn)半徑，η為介質(zhì)粘度，ν為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度，當(dāng)質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中作穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)時(shí)：F＝F′即QE＝6πrην球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點(diǎn)的電泳遷移率。電泳遷移率（m）是指在單位電場(chǎng)強(qiáng)度（1V/cm）時(shí)帶電分子的遷移速度遷移率與帶電分子

3、所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。為了獲得好的電泳結(jié)果，應(yīng)盡量減少電荷效應(yīng)，增加分子篩效應(yīng)。常用的凝膠電泳有兩類：瓊脂糖凝膠電泳：分辨率稍低，適于較大分子。聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨率高，適于較小分子。一、影響凝膠電泳遷移率的因素（一）樣品的物理性質(zhì)1、分子大小線狀雙鏈DNA分子長(zhǎng)度（堿基對(duì)數(shù)目bp）的對(duì)數(shù)（log10）與遷移距離成反比，以此來(lái)測(cè)定DNA片段（線性雙鏈）的分子量準(zhǔn)

4、確且方便。EB嵌合使遷移率下降15%。當(dāng)DNA分子大小超過20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，分子大小不宜超過此值。2、分子的空間構(gòu)型：即使分子量相同，構(gòu)型不同，其遷移率也不同。DNA分子的空間構(gòu)型對(duì)泳動(dòng)率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動(dòng)率的大小順序?yàn)椋汗矁r(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosecircularDNA，cccDNA，超螺旋構(gòu)型）＞lDNA（linearform，線型，質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子）＞ocDNA（開環(huán)DNA，opencircularDNA，ocDNA，它的雙鏈中的

5、一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個(gè)切口）。但是由于瓊脂糖濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、離子強(qiáng)度和溴化乙錠等的影響，會(huì)出現(xiàn)相反的情況。3、帶電量：核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離，所以分子帶正電，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；而pH8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對(duì)泳動(dòng)速度影響不大。4、堿基組成：對(duì)遷移率影響不明顯，單鏈DNA形成發(fā)頭結(jié)構(gòu)，影響遷移率，單鏈（1kb）小于雙鏈DNA（1kb）(二)支持物介質(zhì)（種類和濃度）核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和

6、聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，適于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長(zhǎng)鏈，并通過交聯(lián)劑N,N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大小由Acr與Bis的相對(duì)比例決定。凝膠濃度濃度越小，孔徑越大，濃度越大，孔徑越小。不同濃度瓊脂糖凝膠的有效分離范圍濃度%（W/V）線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.35－600.61－200.70.8－100.90.5－71.20.4－61.51.2－32

7、.00.1－2DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍聚丙烯酰胺濃度有效分離范圍（bp）二甲苯青FF溴酚藍(lán)3.51000－20004601005.080－500260658.060－4001604512.040－200702015.025－150601520.06－1004512（三）電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度是指單位長(zhǎng)度（cm）的電位降，也稱電勢(shì)梯度。1-5V/cm（低壓），低壓時(shí)，線性DNA遷移率與電壓成正比，而對(duì)于大片段電泳，甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒