畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)

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1、丁香園電子期刊2003年10月創(chuàng)刊號(hào)第一期畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)Jnuxz丁香園虛擬社區(qū)蛋白質(zhì)技術(shù)討論版大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)最突出的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)成本低。然而，許多蛋白質(zhì)在翻譯后，需經(jīng)過(guò)翻譯后的修飾加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過(guò)程才能轉(zhuǎn)化成活性形式。大腸桿菌缺少上述加工機(jī)制，不適合用于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)。另外，蛋白質(zhì)的活性還依賴于形成正確的二硫鍵并折疊成高級(jí)結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)往往不能進(jìn)行正確的折疊，是以包含體狀態(tài)存在。包含體的形成雖然簡(jiǎn)化了產(chǎn)物的純化，但不利于產(chǎn)物的活性，為了得到有活性的蛋白，就需要進(jìn)行變性溶解及

2、復(fù)性等操作，這一過(guò)程比較繁瑣，同時(shí)增加了成本。大腸桿菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)前已商業(yè)化的基因工程產(chǎn)品大多是通過(guò)大腸桿菌表達(dá)的，其主要優(yōu)點(diǎn)是成本低、產(chǎn)量高、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，其產(chǎn)物往住形成沒(méi)有活性的包涵體，需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等處理，才能應(yīng)用。近年來(lái)，以酵母作為工程菌表達(dá)外源蛋白日益引起重視，原因是與大腸桿菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有細(xì)胞生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡(jiǎn)單等原核生物的特點(diǎn)外，又具有真核生物時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工，修飾，合理的空間折疊等功能，非常有利

3、于真核基因的表達(dá)，能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足。因此酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來(lái)越多的重視和利用。［1］。同時(shí)與大腸桿菌相比，作為單細(xì)胞真核生物的酵母菌具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力。釀酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遺傳學(xué)方面被人們的認(rèn)識(shí)最早，也是最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主。1981年釀酒酵母表達(dá)了第一個(gè)外源基因----干擾素基因［2］，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達(dá)［3、4、5、6］。干擾素和胰島素雖然已經(jīng)利用釀酒酵母大量生產(chǎn)并被廣泛應(yīng)用，當(dāng)利用釀酒酵母制備時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的

4、結(jié)果很令人鼓舞，但由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到工業(yè)規(guī)模時(shí)，其產(chǎn)量迅速下降。原因是培養(yǎng)基中維特質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失［7、8］，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降?？截悢?shù)是高效表達(dá)的必備因素，因此拷貝數(shù)下降，也直接導(dǎo)致外源基因表達(dá)量的下降。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基成分復(fù)雜且昂貴，當(dāng)采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時(shí)，導(dǎo)致了產(chǎn)量的下降［9］。為克服釀酒酵母的局限，1983年美國(guó)Wegner等人最先發(fā)展了以甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母（methylotrophicyeast）為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)［10］。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（畢赤巴斯

5、德酵母）為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來(lái)發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛。畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)［1、9、11］；⑴具有醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一。丁香園電子期刊2003年10月創(chuàng)刊號(hào)第一期⑵表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合。⑶菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高。⑷畢赤酵母中存在過(guò)氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用。Pichia.pastoris基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)近十年發(fā)展，已基本成為較完

6、善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子AOX1，已高效表達(dá)了HBsAg、TNF、EGF、破傷風(fēng)毒素C片段、基因工程抗體等多種外源基因［11、12、13］，證實(shí)該系統(tǒng)為高效、實(shí)用、簡(jiǎn)便，以提高表達(dá)量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且非常適宜擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模［14］。目前美國(guó)FDA已能評(píng)價(jià)來(lái)自該系統(tǒng)的基因工程產(chǎn)品，最近來(lái)自該系統(tǒng)的Cephelon制劑已獲得FDA批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的．Pichia.pastoris表達(dá)系統(tǒng)在生物工程

7、領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來(lái)越重要的作用，促進(jìn)更多外源基因在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，提供更為廣泛的基因工程產(chǎn)品［9、11］。近年來(lái)，Invitrogon公司開(kāi)發(fā)了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，短短幾年已經(jīng)有300多種外源蛋自在該系統(tǒng)得到有效表達(dá)，被認(rèn)為是目前最有效的酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115＋茵株具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點(diǎn)彼ARG4基因插s入，表型為Mut，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無(wú)天

8、然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外