《沉淀反應(yīng)》PPT課件(I)

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1、第五章　沉淀反應(yīng)(precipitationreaction)指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)+-形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物,反應(yīng)慢。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比濁法中的終點(diǎn)法就是測定此階段形成的復(fù)合物第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測定免疫復(fù)合物形成的速率。沉淀反應(yīng)的原理抗原與抗體反應(yīng)多克隆抗體非常適用于免疫沉淀試驗(yàn)。單克隆抗體抗原表面只有一種表位，不易形成交聯(lián)，單克隆抗體一般不適用于免疫沉淀試驗(yàn)，抗原表面有2個(gè)以上相同的表位，單克

2、隆抗體也可用于免疫沉淀試驗(yàn)。R型抗體：沉淀反應(yīng)中多用。環(huán)狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳液相沉淀試驗(yàn)?zāi)z沉淀試驗(yàn)免疫電泳試驗(yàn)沉淀反應(yīng)分類免疫濁度試驗(yàn)免疫投射濁度測定免疫散射濁度測定第一節(jié)　液相沉淀試驗(yàn)（自學(xué)）液相沉淀試驗(yàn)是指可溶性抗原與抗體在含電解質(zhì)的液體介質(zhì)中反應(yīng)，形成肉眼可見的沉淀物。經(jīng)典的液相沉淀試驗(yàn)：絮狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)第二節(jié)　凝膠沉淀試驗(yàn)（gelphaseprecipitation）指可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬?/p>

3、肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。常用的凝膠：瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。原理凝膠孔徑>3nm，抗原或抗體分子（<3nm）可在其中自由運(yùn)動。分子越大，擴(kuò)散越慢，可據(jù)此識別分子量的差異。當(dāng)抗原抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，分子量在百萬以上，則被網(wǎng)絡(luò)在凝膠中，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物。凝膠沉淀試驗(yàn)的分類單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（singleimmunodiffusiontest）雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（doubleimmunodiffusiontest）一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（一）原理待測抗原溶液在含有相應(yīng)抗體的凝膠內(nèi)自由擴(kuò)散，在二者比例適當(dāng)處出現(xiàn)白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小

4、與抗原濃度呈正相關(guān)。用一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為標(biāo)本中抗原定量的依據(jù)。（二）技術(shù)要點(diǎn)①用電解質(zhì)溶液配制10g/L的瓊脂糖凝膠，加熱溶解后，放56℃水浴平衡溫度；②瓊脂糖冷至56℃后，加入一定量的抗體血清，充分混勻；③傾注瓊脂糖板，瓊脂糖厚2mm，凝固后打孔，孔徑3mm，孔距10～12mm；④孔內(nèi)定量加入待測抗原溶液或不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液；⑤濕盒37℃，24～48h，測量沉淀環(huán)的大小。抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原①傾注平板②打孔③加樣④放置37℃,24～48h觀察沉淀環(huán)單向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）俯視圖側(cè)面圖打孔抗體抗原單向擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)

5、果上排為5個(gè)不同濃度的參考品；下排為患者血清。1.Mancini曲線：大分子抗原（IgM）時(shí)間擴(kuò)散＞48h，常數(shù)C＝Kd2普通坐標(biāo)紙曲線C為抗原濃度，d為沉淀環(huán)直徑，K為常數(shù)（三）數(shù)據(jù)處理T1為16～24h；T2為24～48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線Mancini曲線2.Fahey曲線：小分子抗原（IgG,IgA）擴(kuò)散時(shí)間24h常數(shù)logC=kd半對數(shù)坐標(biāo)紙曲線C為抗原濃度，d為沉淀環(huán)直徑，K為常數(shù)t1為16～24h；t2為24～48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Fahey曲線（四）應(yīng)用與評價(jià)本法為經(jīng)

6、典抗原定量技術(shù)，常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等血漿蛋白的定量測定。若將一定濃度的抗原加入凝膠中，也可檢測抗體濃度，稱為逆向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（reversedimmunodiffusiontest），其主要用于熒光抗體、酶標(biāo)抗體和抗血清中抗體蛋白含量的測定。操作簡單，無需特殊設(shè)備，重復(fù)性和線性均可信。但靈敏度稍差（1.25mg/L），耗時(shí)長，影響因素多。（一）原理：將抗原抗體分別加在凝膠板不同的對應(yīng)孔中，兩者在凝膠中自由擴(kuò)散，在比例合適處形成白色沉淀線。（二）技術(shù)要點(diǎn)：平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔（成對或梅花形），孔徑為3m

7、m，孔間距在3～5mm之間，在相對的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒37℃24～48h后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀線。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)抗體抗原（三）影響因素1.抗原抗體特異性要強(qiáng)，否則將會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。2.抗原抗體比例要適當(dāng)，二者比例適當(dāng)時(shí)，出現(xiàn)一條清晰的纖細(xì)的沉淀線。若比例不適當(dāng)沉淀線將變得寬而模糊，甚至不出現(xiàn)沉淀線，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。3.溫度低，抗原抗體反應(yīng)慢；分子越大，擴(kuò)散速度越慢，時(shí)間越長。4.瓊脂板厚度也將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（四）應(yīng)用與評價(jià)1.抗原或抗體的定性分析用已知抗體（或抗原）檢測未知抗原（

8、或抗體）。2.抗體效價(jià)測定在梅花形孔的中央孔放定量抗原，周邊孔放不同稀釋度的相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀線的抗體最高稀釋倍數(shù)為該抗