變性梯度凝膠電泳DGGE

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1、變性梯度凝膠電泳（DGGE）hnxide一、原理及定義變性梯度凝膠電泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測(cè)DNA片段中的點(diǎn)突變，DGGE是最靈敏的突變檢測(cè)方法，其效率可達(dá)99%（Grompe1993）。Muyzer等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究，現(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一DGGE在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用1）廣泛應(yīng)用于各微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括

2、土壤，活性污泥，人體和動(dòng)物腸道，溫泉，植物根系，海洋，淡水湖，油藏等。絕大部分研究都是通過擴(kuò)增細(xì)菌或古細(xì)菌的16SrRNA基因來研究各生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌或古細(xì)菌群落多樣性。也有用真菌的通用引物擴(kuò)增18SrRNA基因，從而研究真菌的群落多樣性。2）能快速同時(shí)對(duì)比分析大量的樣品。因此它既可以對(duì)比分析不同的微生物群落之間的差異，也可以研究同一個(gè)微生物群落隨時(shí)間和外部環(huán)境壓力的變化過程。3）它可以跟蹤監(jiān)測(cè)細(xì)菌的富集和分離，從而評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)分離菌種的影響4）檢測(cè)單個(gè)純菌rRNA基因的微異質(zhì)性；比較不同的

3、DNA提取方法；另外，它還可以輔佐篩選克隆文庫以及檢測(cè)PCR和克隆過程中的偏差PCR反應(yīng)16SrDNA聚丙烯酰胺凝膠電泳解鏈溫度解鏈溫度既使是很小的變化也會(huì)引起DNA片段Tm值的改變，如單堿基替代可引起1.5℃的差異DGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來DGGE過程：1----2-----3----4思考：DGGE可以用來檢測(cè)除最高溫度解鏈區(qū)域以外的所有發(fā)生單個(gè)堿基變化的DNA片段，但是最后一個(gè)區(qū)域的解鏈，雙鏈變單鏈，會(huì)

4、出現(xiàn)什么結(jié)果？如何解決？DGGE前PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)根據(jù)16S的一段保守序列設(shè)計(jì)，長度15-25bpGC夾子:設(shè)計(jì)一段富含GC夾子的引物，使DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30-50個(gè)堿基對(duì)）可以解決雙鏈DNA完全解鏈的問題,經(jīng)驗(yàn)表明任何隨機(jī)的GC序列都能達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蠫C夾子的DNA片段最高的解鏈區(qū)域在GC夾子這一段序列處，它的解鏈溫度很高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC夾子后，DNA片段中基本上每個(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。凝膠變性劑濃度梯度的

5、確定在分析微生物群落的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，一般先要用垂直電泳來確定一個(gè)大概的變性劑范圍垂直電泳和水平電泳A：凝膠的變性梯度方向與電泳方向垂直。B：左泳道，突變型等位基因；中，野生型等位基因；右，突變型與野生型等位基因電泳時(shí)間的確定一般采用時(shí)間間歇（timetravel）的方法，即每隔一定時(shí)間加一次樣品，從而使樣品的電泳時(shí)間有一個(gè)梯度，根據(jù)這個(gè)結(jié)果，確定最佳的電泳時(shí)間根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)染色方法的選擇：溴化乙啶（ethidiumbromide,EB），SYBRGreenI,SYBRGold和銀染法。染色法的

6、優(yōu)缺點(diǎn)EB法染色的靈敏度最低，且致癌，但價(jià)廉。SYBRGreenI和SYBRGold相比EB，能更好地消除染色背景，因此它們的檢測(cè)靈敏度比EB法高很多。EB和SYBR染色時(shí)，雙鏈DNA能很好地顯色，單鏈DNA基本上不能顯色。銀染法的靈敏度最高，它不但能染雙鏈DNA，也能染單鏈DNA，但它的缺點(diǎn)是不能用于隨后的雜交分析三、DGGE法的優(yōu)缺點(diǎn)突變體檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)1、幾乎可以檢出所有突變2、可將突變分子完好無損地同野生型分子分開用于進(jìn)一步的分析3、無須標(biāo)記4、電泳前只需一步操作5、可用于未經(jīng)擴(kuò)增的基因組DNA6、可檢

7、測(cè)出象甲基化這樣的DNA修飾缺點(diǎn)1、需要專門設(shè)備需要用計(jì)算機(jī)對(duì)序列進(jìn)行分析2、需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)需要昂貴的“GC夾板”3、無法確定突變?cè)贒NA片段中位置4、需要用含有毒性物質(zhì)甲酰胺的梯度凝膠5、DNA片段大小限制在100-500bp微生物生態(tài)學(xué)中應(yīng)用的缺點(diǎn)除了前面提到過的一些優(yōu)缺點(diǎn)，分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成是還存在以下缺點(diǎn)：1、分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成時(shí)，有很多偏差。不同細(xì)菌的基因組大小和核糖體RNA拷貝數(shù)不同；提取基因組總DNA時(shí)細(xì)胞的裂解效率不同；DNA提取和純化時(shí)有偏差；PCR擴(kuò)增過程中有偏差。2、DGGE

8、一般只能分析500個(gè)堿基對(duì)以下的DNA片段，因此得到的系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)的信息就很少做DGGE注意事項(xiàng)1、配置試劑時(shí)一定要用去離子水，制膠洗膜時(shí)用的各個(gè)容器也要用去離子水洗滌干凈，以防止氯離子污染。2、制膠是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，用連有聚乙烯管標(biāo)有‘高濃度’的注射器吸取所有高濃度的膠，對(duì)于低濃度的膠操作同上，在往玻璃板中灌膠時(shí)，要?jiǎng)蛩俚剞D(zhuǎn)動(dòng)滑輪，將凝膠液勻速地灌入玻璃板。3、分別將高濃度、低濃度注射器放在梯度傳送系統(tǒng)的正確一側(cè)固定好，注意這里