變性梯度凝膠電泳DGGE

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1、變性梯度凝膠電泳（DGGE）hnxide一、原理及定義變性梯度凝膠電泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世紀80年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測DNA片段中的點突變，DGGE是最靈敏的突變檢測方法，其效率可達99%（Grompe1993）。Muyzer等人在1993年首次將其應用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究，現(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學方法之一DGGE在微生物生態(tài)學中的應用1）廣泛應用于各微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括

2、土壤，活性污泥，人體和動物腸道，溫泉，植物根系，海洋，淡水湖，油藏等。絕大部分研究都是通過擴增細菌或古細菌的16SrRNA基因來研究各生態(tài)系統(tǒng)中的細菌或古細菌群落多樣性。也有用真菌的通用引物擴增18SrRNA基因，從而研究真菌的群落多樣性。2）能快速同時對比分析大量的樣品。因此它既可以對比分析不同的微生物群落之間的差異，也可以研究同一個微生物群落隨時間和外部環(huán)境壓力的變化過程。3）它可以跟蹤監(jiān)測細菌的富集和分離，從而評價不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對分離菌種的影響4）檢測單個純菌rRNA基因的微異質(zhì)性；比較不同的

3、DNA提取方法；另外，它還可以輔佐篩選克隆文庫以及檢測PCR和克隆過程中的偏差PCR反應16SrDNA聚丙烯酰胺凝膠電泳解鏈溫度解鏈溫度既使是很小的變化也會引起DNA片段Tm值的改變，如單堿基替代可引起1.5℃的差異DGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來DGGE過程：1----2-----3----4思考：DGGE可以用來檢測除最高溫度解鏈區(qū)域以外的所有發(fā)生單個堿基變化的DNA片段，但是最后一個區(qū)域的解鏈，雙鏈變單鏈，會

4、出現(xiàn)什么結(jié)果？如何解決？DGGE前PCR引物設(shè)計引物設(shè)計根據(jù)16S的一段保守序列設(shè)計，長度15-25bpGC夾子:設(shè)計一段富含GC夾子的引物，使DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30-50個堿基對）可以解決雙鏈DNA完全解鏈的問題,經(jīng)驗表明任何隨機的GC序列都能達實驗目的含有GC夾子的DNA片段最高的解鏈區(qū)域在GC夾子這一段序列處，它的解鏈溫度很高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當加了GC夾子后，DNA片段中基本上每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。凝膠變性劑濃度梯度的

5、確定在分析微生物群落的PCR擴增產(chǎn)物時，一般先要用垂直電泳來確定一個大概的變性劑范圍垂直電泳和水平電泳A：凝膠的變性梯度方向與電泳方向垂直。B：左泳道，突變型等位基因；中，野生型等位基因；右，突變型與野生型等位基因電泳時間的確定一般采用時間間歇（timetravel）的方法，即每隔一定時間加一次樣品，從而使樣品的電泳時間有一個梯度，根據(jù)這個結(jié)果，確定最佳的電泳時間根據(jù)以往經(jīng)驗，參考文獻染色方法的選擇：溴化乙啶（ethidiumbromide,EB），SYBRGreenI,SYBRGold和銀染法。染色法的

6、優(yōu)缺點EB法染色的靈敏度最低，且致癌，但價廉。SYBRGreenI和SYBRGold相比EB，能更好地消除染色背景，因此它們的檢測靈敏度比EB法高很多。EB和SYBR染色時，雙鏈DNA能很好地顯色，單鏈DNA基本上不能顯色。銀染法的靈敏度最高，它不但能染雙鏈DNA，也能染單鏈DNA，但它的缺點是不能用于隨后的雜交分析三、DGGE法的優(yōu)缺點突變體檢測優(yōu)點1、幾乎可以檢出所有突變2、可將突變分子完好無損地同野生型分子分開用于進一步的分析3、無須標記4、電泳前只需一步操作5、可用于未經(jīng)擴增的基因組DNA6、可檢

7、測出象甲基化這樣的DNA修飾缺點1、需要專門設(shè)備需要用計算機對序列進行分析2、需要進行預實驗需要昂貴的“GC夾板”3、無法確定突變在DNA片段中位置4、需要用含有毒性物質(zhì)甲酰胺的梯度凝膠5、DNA片段大小限制在100-500bp微生物生態(tài)學中應用的缺點除了前面提到過的一些優(yōu)缺點，分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成是還存在以下缺點：1、分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成時，有很多偏差。不同細菌的基因組大小和核糖體RNA拷貝數(shù)不同；提取基因組總DNA時細胞的裂解效率不同；DNA提取和純化時有偏差；PCR擴增過程中有偏差。2、DGGE

8、一般只能分析500個堿基對以下的DNA片段，因此得到的系統(tǒng)進化相關(guān)的信息就很少做DGGE注意事項1、配置試劑時一定要用去離子水，制膠洗膜時用的各個容器也要用去離子水洗滌干凈，以防止氯離子污染。2、制膠是實驗的關(guān)鍵，用連有聚乙烯管標有‘高濃度’的注射器吸取所有高濃度的膠，對于低濃度的膠操作同上，在往玻璃板中灌膠時，要勻速地轉(zhuǎn)動滑輪，將凝膠液勻速地灌入玻璃板。3、分別將高濃度、低濃度注射器放在梯度傳送系統(tǒng)的正確一側(cè)固定好，注意這里