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《實(shí)驗(yàn)四離子交換層析分離單核苷酸》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)四離子交換層析 分離單核苷酸目的要求通過(guò)以強(qiáng)堿性離子交換樹(shù)脂分離單核苷酸，學(xué)習(xí)和掌握離子交換層析的原理和操作方法。離子交換層析（IonExchangeChromatography簡(jiǎn)稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動(dòng)相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同進(jìn)行分離純化的層析方式。離子交換層析的基本原理樹(shù)脂－N+(CH3)—OH-離子交換層析的基本原理離子交換劑由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或稱功能基團(tuán)）和反離子組成。基質(zhì)一般是不溶性聚合物，如樹(shù)脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；纖維素－O—CH
2、2—COO-—Na＋基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子RA+B＋RB＋A+(RA是陽(yáng)離子交換劑，B為溶液中的離子或待分離的生物分子）離子交換層析的基本原理當(dāng)[A+]=[B+],[RB]>[RA],說(shuō)明R－與B＋的結(jié)合力比A＋大；反之亦然。對(duì)于兩性蛋白而言，結(jié)合力取決于其等電點(diǎn)以及溶液的pH值。平衡裝柱離子交換劑帶上反離子(R-O-X+)上樣樣品（A＋,B+，C+，等）與反離子（X＋）競(jìng)爭(zhēng)與電荷基團(tuán)結(jié)合；（結(jié)合力A＋>B+>Y+>C+>X＋）洗脫洗脫液中的離子成分（Y＋）與樣品(A＋等）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合電荷基團(tuán)，首先C洗下來(lái)，隨著Y＋濃度
3、增加，B＋洗脫出，最后A＋出來(lái)，使樣品分離。所以從上樣到洗脫都是根據(jù)結(jié)合力的大小進(jìn)行進(jìn)行的。洗脫液的選擇很重要，要使有效成分和雜質(zhì)分離。離子交換層析的基本步驟離子交換層析的基本步驟1.單核苷酸的結(jié)構(gòu)堿水解使核酸降解為2’或3’單核苷酸混合物，在2‘，或3’位帶磷酸基團(tuán)。離子交換層析分離單核苷酸的原理2.陰離子交換層析分離單核苷酸的依據(jù)單核苷酸為兩性電解質(zhì)，幾種單核苷酸的等電點(diǎn)AMP2.65GMP2.35CMP4.5UMP1.55按等電點(diǎn)由高到低：CMP>AMP>GMP>UMP但是由于樹(shù)脂對(duì)嘌呤的吸附力大于對(duì)嘧啶的
4、吸附，所以洗脫順序是：CMP-AMP-UMP-GMP如果以陰離子交換劑分離，洗脫順序是：CMP>AMP>GMP>UMP離子交換層析分離單核苷酸的原理3.2’，3‘單核苷酸等電點(diǎn)的差異由于2’和3’核苷酸的磷酸基團(tuán)與堿環(huán)的距離不同，所以堿環(huán)上堿基基團(tuán)的pK值有區(qū)別，所以2’和3’核苷酸的PI值有區(qū)別。2’核苷酸的PI值略高于3‘核苷酸的等電點(diǎn)。所以每種單核苷酸洗脫時(shí)出現(xiàn)2個(gè)峰。離子交換層析分離單核苷酸的原理4.離子交換劑的類型所用的離子交換劑為陰離子交換樹(shù)脂，所帶電荷基團(tuán)為季銨基。樹(shù)脂－N+(CH3)3－離子交換層
5、析分離單核苷酸的原理離子交換層析分離單核苷酸的實(shí)驗(yàn)步驟1）樣品的獲得以KOH37°C水解酵母RNA，生成2’－或3‘－核苷酸混合物。最終pH值調(diào)到8.0（注意核苷酸所帶電荷?。?。具體操作見(jiàn)講義p23。2)交換劑的平衡和裝柱以甲酸鈉溶液平衡，反離子為甲基（COO-）。具體步驟見(jiàn)講義p23。3）加樣以滴管加入1.0ml樣品，以3－4d/min的速度讓其進(jìn)入層析柱。然后以200mlddH2O洗柱至OD260<0.02。離子交換層析分離單核苷酸的實(shí)驗(yàn)步驟4）洗脫并檢測(cè)依次用以下溶液分段洗脫：250ml0.02mol/L甲
6、酸；250ml0.15mol/L甲酸；250ml0.01mol/L甲酸－－0.05mol/L甲酸鈉溶液（pH4.44);250ml0.1mol/L甲酸－－0.1mol/L甲酸鈉溶液（pH3.74);流速1ml/min。收集洗脫液，10ml一管分別進(jìn)行紫外檢測(cè)，并記錄吸收值。離子交換層析分離單核苷酸的實(shí)驗(yàn)步驟5)分析檢測(cè)a.根據(jù)記錄的紫外吸收值，分別做出分步洗脫曲線(如圖所示）。離子交換層析分離單核苷酸的實(shí)驗(yàn)步驟b.保留各組分的洗脫高峰管，作出各組分在230－300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收光譜圖（如圖所示）。思考題
7、通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作，討論有哪些因素會(huì)影響離子交換層析作用的的效果？TheEnd！
