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《各種轉(zhuǎn)染試劑的中文轉(zhuǎn)染方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、各種轉(zhuǎn)染試劑的中文轉(zhuǎn)染方法FuGENE6（Roche）轉(zhuǎn)染步驟：轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分至培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)50-80％融合。將細(xì)胞以1-3×105/2ml接種于6孔板后孵育過夜將達(dá)到如此密度。將FuGENE6Reagent在室溫孵育10-15分鐘。使用之前將FuGENE6顛倒混勻一下。1.在PCR管中加入不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液以稀釋FuGENE6，直至總體積到100ul。2.將3-6ulFuGENE6Reagent直接加入營(yíng)養(yǎng)液，輕彈管壁混合。3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），輕彈管壁混合
2、。4.室溫孵育20分鐘。5.將6孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，加入約1ml不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液洗滌一次，再加入2ml不含血清和雙抗的營(yíng)養(yǎng)液。6.將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞，混勻使之均勻分布。7.3-8小時(shí)后，加入血清或換成含血清的營(yíng)養(yǎng)液。?Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染步驟（6孔板）：1.轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90-95％。細(xì)胞鋪板在2ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。2.對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250ul無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）
3、稀釋4.0ugDNA，輕輕混勻。3.使用前將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用250ul無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋10ulLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine2000稀釋后，在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合（<30分鐘）。NOTE：若使用DMEM培養(yǎng)基，則需在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。4.混合稀釋的DNA（第二步）和稀釋的Lipofectamine2000（第三步）。室溫放置20分鐘。5.（optional）將6孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，用
4、無血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入2ml無血清配養(yǎng)基。6.直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。7.在37℃，5％CO2中保溫24-48小時(shí)。無需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基?；蛘咴?-5小時(shí)后更換培養(yǎng)生長(zhǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。8.在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。貼壁細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞以≥1:10的比例傳代至新鮮培
5、養(yǎng)基中，次日加入選擇性培養(yǎng)基。?Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染步驟（24孔板）：1.轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（0.5-2×105），細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90-95％。細(xì)胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。2.對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50ul無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋0.8-1.0ugDNA，輕輕混勻。3.使用前將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用50ul無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋1-3ulLipofectamin
6、e2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine2000稀釋后，在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合（<30分鐘）。NOTE：若使用DMEM培養(yǎng)基，則需在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。4.混合稀釋的DNA（第二步）和稀釋的Lipofectamine2000（第三步）。室溫放置20分鐘。5.（optional）將24孔板中的舊營(yíng)養(yǎng)液吸出，用無血清培養(yǎng)基清洗兩次。加入0.5ml無血清配養(yǎng)基。6.直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。7.在37℃，5％CO2中保溫24-48小時(shí)。無需去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基。或者在4
7、-5小時(shí)后更換培養(yǎng)生長(zhǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。8.在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。貼壁細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞以≥1:10的比例傳代至新鮮培養(yǎng)基中，次日加入選擇性培養(yǎng)基。?EffecteneTransfectionReagent(Qiagen)轉(zhuǎn)染步驟：以下步驟適用于在6孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。開始時(shí)，每6孔培養(yǎng)板使用
8、0.4ugDNA。盡管DNA的量看起來很少，但已足夠用于轉(zhuǎn)染。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)每種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。1.轉(zhuǎn)染前一天，用5ml含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每6孔培養(yǎng)板含2-8×105的細(xì)胞（根據(jù)細(xì)胞類型而定）。2.在細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)（通常37℃和5％CO2）。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)40-80％融合。3.轉(zhuǎn)染時(shí)，用DNA濃縮
