基因表達量實時熒光定量PCR檢測步驟

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1、基因表達量實時熒光定量PCR檢測步驟1材料(試劑和耗材)1.1樣本(小鼠組織)-2個1.2引物(lifetechnology公司合成)1.3BestarTMqPCRRTKit(德國DBI貨號:DBI-2220)1.4Bestar?SybrGreenqPCRmastermix(德國DBI貨號:DBI-2043)1.596孔板(美國lifetechnology)2材料(儀器)2.1ABI7500熒光定量PCR儀(lifetechnology公司)2.2TGL-16M低溫冷凍離心機(湘儀)2.3SW-CJ-1D單人凈化工作臺

2、(瀘凈凈化)2.4HR40-ⅡA2生物安全柜(Haier)3實驗步驟3.1RNA的抽提RNA的提取按lifetechnology公司提供的TriozolRNA提取試劑盒的使用說明進行。程序如下:(1)將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1mlTRIzol;(2)加入0.2mL氯仿,蓋緊離心管管蓋,上下顛倒混勻60s(請勿渦漩激烈振蕩),室溫靜置3min,12,000g,4℃離心15min,置于冰上;(3)溶液分為三層,RNA溶解在水相中,小心吸取500μl水相至另一個新的RNasefree的EP管中;(4)加

3、入500μl異丙醇,-20度放置1h,12,000g,4℃離心10min,離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀,棄上清;6(5)加入1ml75%乙醇,用手輕輕顛倒,12,000g離心5min,去上清;(6)超凈工作臺上吹干樣品10min,加入適量DEPC水溶解RNA。加入40μlDEPC水溶解沉淀。3.2RNA質(zhì)量檢測紫外分光光度計測定RNA濃度:sampleIDconcentration(ng/μL)260/280a9981.87b10241.973.3去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱,室溫10,000

4、g離心1min,收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65°C條件下熱變性5分鐘后,立即置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應:5×RTBuffer2μLRTEnzymeMix0.5μLPrimerMix0.5μLRNA6μLRNase-freeWater1μLToal10μL反應條件:37°C,15min98°C,5min4°C,hold反應結(jié)束后,-20°C保存。63.4cDNA的實時熒光定量PCR3.4.1實驗步驟每個樣本分別設置3個目的基因和3個內(nèi)參基因的平行實驗。PCR反應體系為20μL,根據(jù)表1.配置。反應條件

5、為:95°C2min95°C10s45個循環(huán)60°C34s(采集熒光信號)72°C30s循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。表120μl熒光定量PCR反應體系試劑體積(μL)終濃度滅菌蒸餾水4.46/ Bestar?SybrGreenqPCRmastermix101×ForwardPrimer(20μM)0.250.25μMReversePrimer(20μM)0.250.25μM50×ROX0.040.1×模板5/ Total20/ 表2使用的引物基因名稱GenebankID引物序列擴增長度(bp)Mus-G

6、APDHNM_001289726.1Forward:TCCACTCACGGCAAATTCAAC146Reverse:GTAGACTCCACGACATACTCAGCxNM_*****Forward:Reverse:yNM_*****Forward:Reverse:3.4.2實驗結(jié)果的分析方法本實驗采用2-△△Ct法進行分析,計算公式為:F為相對表達量,根據(jù)此次試驗的設計,對照組中的目的基因表達量為1。64結(jié)果4.1擴增曲線GAPDH基因擴增曲線x基因擴增曲線y基因擴增曲線64.2熔解曲線GAPDH基因熔解曲線x基因熔解曲

7、線y基因熔解曲線-24.3實驗數(shù)據(jù)見EXCEL表格。備注:DCt=目的基因Ct-管家基因Ct;DDCt=待測樣品DCt-對照樣品DCt;2-DDCt=相對表達量。4.4柱形圖6廣州輝駿生物科技有限公司6

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