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《基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟1材料（試劑和耗材）1.1樣本（小鼠組織）-2個(gè)1.2引物（lifetechnology公司合成）1.3BestarTMqPCRRTKit（德國(guó)DBI貨號(hào)：DBI-2220）1.4Bestar?SybrGreenqPCRmastermix（德國(guó)DBI貨號(hào)：DBI-2043）1.596孔板（美國(guó)lifetechnology）2材料（儀器）2.1ABI7500熒光定量PCR儀（lifetechnology公司）2.2TGL-16M低溫冷凍離心機(jī)（湘儀）2.3SW-CJ-1D單人凈化工作臺(tái)
2、（瀘凈凈化）2.4HR40-ⅡA2生物安全柜（Haier）3實(shí)驗(yàn)步驟3.1RNA的抽提RNA的提取按lifetechnology公司提供的TriozolRNA提取試劑盒的使用說明進(jìn)行。程序如下：（1）將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1mlTRIzol；（2）加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，上下顛倒混勻60s（請(qǐng)勿渦漩激烈振蕩），室溫靜置3min，12,000g，4℃離心15min，置于冰上；（3）溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取500μl水相至另一個(gè)新的RNasefree的EP管中；（4）加
3、入500μl異丙醇，-20度放置1h，12,000g，4℃離心10min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清；6（5）加入1ml75％乙醇，用手輕輕顛倒，12,000g離心5min，去上清；（6）超凈工作臺(tái)上吹干樣品10min，加入適量DEPC水溶解RNA。加入40μlDEPC水溶解沉淀。3.2RNA質(zhì)量檢測(cè)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度：sampleIDconcentration(ng/μL)260/280a9981.87b10241.973.3去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000
4、g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65°C條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5×RTBuffer2μLRTEnzymeMix0.5μLPrimerMix0.5μLRNA6μLRNase-freeWater1μLToal10μL反應(yīng)條件：37°C,15min98°C,5min4°C,hold反應(yīng)結(jié)束后，-20°C保存。63.4cDNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR3.4.1實(shí)驗(yàn)步驟每個(gè)樣本分別設(shè)置3個(gè)目的基因和3個(gè)內(nèi)參基因的平行實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為20μL，根據(jù)表1.配置。反應(yīng)條件
5、為：95°C2min95°C10s45個(gè)循環(huán)60°C34s（采集熒光信號(hào)）72°C30s循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。表120μl熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑體積（μL）終濃度滅菌蒸餾水4.46/ Bestar?SybrGreenqPCRmastermix101×ForwardPrimer(20μM)0.250.25μMReversePrimer(20μM)0.250.25μM50×ROX0.040.1×模板5/ Total20/ 表2使用的引物基因名稱GenebankID引物序列擴(kuò)增長(zhǎng)度（bp）Mus-G
6、APDHNM_001289726.1Forward：TCCACTCACGGCAAATTCAAC146Reverse：GTAGACTCCACGACATACTCAGCxNM_*****Forward：Reverse：yNM_*****Forward：Reverse：3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析方法本實(shí)驗(yàn)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，計(jì)算公式為：F為相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)此次試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，對(duì)照組中的目的基因表達(dá)量為1。64結(jié)果4.1擴(kuò)增曲線GAPDH基因擴(kuò)增曲線x基因擴(kuò)增曲線y基因擴(kuò)增曲線64.2熔解曲線GAPDH基因熔解曲線x基因熔解曲
7、線y基因熔解曲線-24.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見EXCEL表格。備注：DCt=目的基因Ct-管家基因Ct；DDCt=待測(cè)樣品DCt-對(duì)照樣品DCt；2-DDCt=相對(duì)表達(dá)量。4.4柱形圖6廣州輝駿生物科技有限公司6
