實驗三 大豆中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測

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1、大豆中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測一、實驗?zāi)康?1)學(xué)習(xí)從各種材料動物、植物組織、微生物中提取和純化DNA的原理和操作技術(shù)。(2)學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳及紫外檢測確定DNA的純度、含量與分子大小。(3)學(xué)習(xí)PCR的基本原理和操作方法。(4)掌握高速冷凍離心機、微量移液槍、水平電泳儀、PCR儀等儀器設(shè)備的使用。二、實驗原理由于現(xiàn)有的商品化轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中絕大多數(shù)含35S啟動子和NOS終止子。故轉(zhuǎn)基因食品的檢測一般基于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法對35S啟動子和NOS終止子進行篩選。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是近年來常用的一種快速、靈敏的檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方法,但要求待分析的基因組D

2、NA樣品盡可能純化。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。三、PCR引物設(shè)計檢測對象Detecttarget引物名稱Primername引物序列Primersequence擴增產(chǎn)物長度Productionlength基因庫中序列號GenebankdatabaseaccessionnumberCaMV35S啟動子35S-15'-TCATCCCTTACGTCAGTGGAG-3'165bpI0807635S-25'-CCATCATTGCGATAAAGGAAA-3'NOS終止子NOS

3、-15'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'180bpI08076NOS-25'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3'農(nóng)桿菌CP4-EPSPSCP4-15'-GCAAATCCTCTGGCCTTTCC-3'146bpI43998CP4-25'-CTTGCCCGTATTGATGACGTC-3'凝集素基因Lectin-15'-CTTCGCCGCTTCCTTCAAC-3'436bpK00821Lectin-25'-GAGTCCCGTGGCAGCAGAG-3'表1　引物序列及擴增產(chǎn)物長度四、轉(zhuǎn)基因大豆抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆品種京引D-1、京引D-2、京引D-3、京引D

4、-4獲市面上購買的轉(zhuǎn)基因大豆，萬能粉碎機粉碎。五、DNA的提取1、稱取約0.1g磨碎的大豆放入滅過菌的研體中加入液氮搗碎迅速轉(zhuǎn)入2ml離心管中；2、加入600μlCTAB(十六烷基三甲基溴化銨)緩沖液震蕩均勻，65℃水浴保溫30min；3、加入500μl酚：三氯甲烷：異戊醇(25:24:1)，振蕩均勻，12000r/min離心15min； 4、吸取上清液，放入另一新管中加入500ul的異丙醇，12000r/min離心10min。5、棄去上清液，加入70%乙醇溶液洗滌，12000r/min離心1min。6、棄去上清液，干燥，用50μlTE緩沖溶液溶解沉淀。7、加入5μlRN

5、A酶溶液，37℃水浴保溫30min。8、加入400μl的CTAB緩沖溶液，振蕩均勻。9、加入250μl的三氯甲烷：異戊醇(1:1)，振蕩均勻，12000r/min離心15min。10、吸取上清液，放入另一個新管中，加入200μl的異丙醇，12000r/min離心10min。11、棄去上清液，干燥，用50μlTE緩沖液溶解沉淀。12、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的大小和完整性。一、PCR擴增反應(yīng)體系試劑加樣體積(μl)ddH2O1710XPCRBuffer(withMgCl2)2.5dNTP(10mM)2正向引物(10μM)1反向引物(10μM)1樣品DNA(10-50ng)1

6、Taq酶(IU/ul)0.5總體積25注：如何10XPCRBuffer沒有包含鎂離子，另外加2μlMgCl2(25mM)溶液二、PCR反應(yīng)程序95℃預(yù)變性5min后,進行40個循環(huán);每個循環(huán),退火30s,72℃延伸1min,循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min,然后4℃保存。PCR反應(yīng)程序95℃預(yù)變性5min94℃變性45s35個循環(huán)56℃退火45s72℃延伸1min72℃延伸5min4℃保存一、電泳的步驟1.瓊脂糖凝膠液的制備 2.凝膠板的制備 3.加樣 4.電泳 5.染色6.觀察DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳圖分析采用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行分析；電泳緩沖液采用1×TAE或0.

7、5×TBE；電泳條件為：100V，30min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進行分析或用核酸紫外觀測儀進行觀測拍照與結(jié)果分析。二、說明及注意事項避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標(biāo)DNA的污染等。三、思考題1.轉(zhuǎn)基因植物PCR基因擴增的基本原理。2.轉(zhuǎn)基因植物PCR基因擴增操作時應(yīng)注意的問題。