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《SN 1135.5-2007馬鈴薯環(huán)腐病菌檢疫鑒定方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)犛犖／犜１１３５．５—２００７馬鈴薯環(huán)腐病菌檢疫鑒定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊狊狌犫狊狆．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊２００７１２２４發(fā)布２００８０７０１實(shí)施中華人民共和國(guó)發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局犛犖／犜１１３５．５—２００７前言ＳＮ／Ｔ１１３５共分為五個(gè)部分：———馬鈴薯癌腫病檢疫鑒定方法；———馬鈴薯黃化矮縮病毒檢疫鑒定方法；———馬鈴薯帚頂病毒檢疫鑒定方法；———馬鈴薯黑粉病菌檢疫鑒定方法；———馬鈴薯環(huán)腐病菌檢疫鑒定方法。本部分是ＳＮ／Ｔ１１３５的第５部分。本部分的附錄Ｂ、附錄Ｃ均為
2、規(guī)范性附錄，附錄Ａ為資料性附錄。本部分由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本部分起草單位：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局。本部分主要起草人：趙文軍、陳紅運(yùn)、梁新苗、張樂(lè)、朱水芳、魏梅生。本部分系首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ犛犖／犜１１３５．５—２００７馬鈴薯環(huán)腐病菌檢疫鑒定方法１范圍ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分規(guī)定了馬鈴薯環(huán)腐病菌的檢疫鑒定方法。本部分適用于所有進(jìn)出境馬鈴薯種薯及商品用薯的檢疫和鑒定。２術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分。２．１雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定在固相支持物上（酶聯(lián)板）包被細(xì)菌特異性抗體，加入待測(cè)樣品后，再用酶
3、標(biāo)記的細(xì)菌抗體進(jìn)行免疫識(shí)別，最后通過(guò)酶促化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)細(xì)菌是否存在的一種血清學(xué)檢測(cè)方法。２．２犘犆犚以耐熱ＤＮＡ聚合酶和一對(duì)引物（與待測(cè)目標(biāo)核酸分子序列同源的ＤＮＡ片段）通過(guò)高溫（ＤＮＡ分子變性）和低溫（引物和目標(biāo)核酸分子復(fù)性并被耐熱ＤＮＡ聚合酶延伸）交替循環(huán)擴(kuò)增待測(cè)目標(biāo)核酸分子的方法。３原理馬鈴薯環(huán)腐病菌（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊），屬厚壁菌門(mén)（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）厚壁細(xì)菌綱（Ｆｉｒｍｉｂａｃｔｅｒｉａ）棒形桿菌屬（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉），依靠病薯進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。寄主及世界分布參見(jiàn)附錄Ａ。４儀器和用具４．１儀器設(shè)備ＰＣＲ儀、超凈
4、工作臺(tái)、滅菌鍋、制冰機(jī)、核酸蛋白分析儀、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式小型離心機(jī)、超低溫冰箱、常規(guī)冰箱、旋渦振蕩器、微量進(jìn)樣器、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀。４．２主要試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。ＰＣＲ緩沖液、氯化鎂（ＭｇＣｌ）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、２ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、引物和探針、牛肉汁、酵母膏、磷酸氫二鉀（Ｋ２ＨＰＯ４）、磷酸二氫鉀（ＫＨ）、硫酸鎂（ＭｇＳＯ）、葡萄糖、瓊脂，酶聯(lián)檢測(cè)試劑見(jiàn)附錄Ｂ。２ＰＯ４４５病菌的鑒定５．１癥狀檢查取樣品量１％～５％（若樣品少可適量增大比例）的塊莖進(jìn)行檢查。將塊莖橫切，檢查環(huán)腐病菌侵染癥狀，擠壓塊莖，檢查維管組織是否浸
5、解。發(fā)病輕者維管束變黃，呈不連續(xù)的點(diǎn)狀變色；重者整個(gè)維管束環(huán)變色。病菌也可侵害塊莖維管束周?chē)谋”诮M織，呈環(huán)狀腐爛，嚴(yán)重時(shí)可引起皮層與髓部組織分離，輕輕擠壓塊莖從維管束中涌出奶酪樣的柱狀物。塊莖表面的癥狀在輕度危害時(shí)不明顯，隨病害發(fā)展，皮色變暗或變褐，嚴(yán)重時(shí)表皮可出現(xiàn)裂縫。５．２雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)樣品進(jìn)行初篩（見(jiàn)附錄Ｂ），若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，需進(jìn)行病原１犛犖／犜１１３５．５—２００７菌的分離培養(yǎng)及５．４方法測(cè)定。５．３病原菌的分離培養(yǎng)５．３．１培養(yǎng)基的制備營(yíng)養(yǎng)肉湯酵母膏培養(yǎng)基（ＮＢＹ）：牛肉汁８．０ｇ，酵母膏２．０ｇ，磷酸氫二鉀（Ｋ）２．０ｇ，磷酸二
6、２ＨＰＯ４氫鉀（ＫＨ）０．５ｇ，葡萄糖２．５ｇ，瓊脂１５．０ｇ，水１Ｌ，滅菌后加１ｍＬ過(guò)濾滅菌的１ｍｏｌ／Ｌ硫酸鎂２ＰＯ４（ＭｇＳＯ）溶液。４５．３．２塊莖中病原菌的分離培養(yǎng)馬鈴薯塊莖洗凈后用７５％乙醇表面消毒５ｍｉｎ，從帶病薯塊的維管束挑取少量菌膿在ＮＢＹ培養(yǎng)基上劃線或從帶病塊莖的維管束圈切取少量病組織，在滅菌水中搗碎制成懸浮液，用接菌環(huán)蘸菌懸液劃線，經(jīng)兩次純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基斜面。５．４犘犆犚凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)附錄Ｃ。６結(jié)果判定若酶聯(lián)免疫檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，可初步判定為檢出馬鈴薯環(huán)腐病菌，需利用５．４方法進(jìn)一步檢測(cè)。在５．４檢測(cè)中，若ＰＣＲ凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而且擴(kuò)增片段大小與描述相符可判
7、定為馬鈴薯環(huán)腐病菌。７樣品保存與復(fù)核７．１樣品保存與處理樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存。對(duì)檢出馬鈴薯環(huán)腐病菌的樣品應(yīng)保存于４℃冰箱中，以備復(fù)核。該類(lèi)樣品保存期滿(mǎn)后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理。７．２菌株保存與處理從檢測(cè)樣品中分離并鑒定為馬鈴薯環(huán)腐病菌的菌株，應(yīng)妥善保存。將菌株接種于ＮＢＹ培養(yǎng)基斜面上，２８℃培養(yǎng)４８ｈ，然后４℃冰箱保存，或液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入２０％滅菌甘油并混勻，－８０℃長(zhǎng)期保存或用安瓿管冷凍干燥長(zhǎng)期保
