DNA、RNA的提取、純化與鑒定

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1、DNA/RNA的提取、純化與鑒定編輯詞條發(fā)表評(píng)論（0）目錄DNA的提取純化基因組DNA的提取從植物組織提取基因組DNA從動(dòng)物組織捉?取基因組DNA細(xì)菌基因組DNA的制備基因組DNA的檢測(cè)組織DNA的提取和純化石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用外周血DNA提取技術(shù)真核細(xì)胞DNA的制備植物組織中DNA的提取細(xì)菌DNA的提取方法真菌DNA提取總結(jié)的兩種方法組織mRNA提取操作步驟RNA酶活性的控制用杲硫氤酸弧和有機(jī)溶劑提取RNAmRNA的分離哺乳動(dòng)物細(xì)胞總RNA的分離植物總RNA的分離植物mRNA的分離PCR常

2、見問題分析瓊脂糖凝膠DNA回收常見問題分析RNA提取常見問題分析DNA電泳常見問題分析質(zhì)粒提収簾見問題分析凝膠電泳操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)：DNA片段的回收及純化實(shí)驗(yàn)：RNA的提取及其純度檢測(cè)［顯示部分］DNA的提取純化編輯木段冋目錄一、細(xì)菌培養(yǎng)物的牛長(zhǎng)從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中（冇含冇行當(dāng)抗生索的液體培養(yǎng)慕中生長(zhǎng)），然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的捉純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時(shí)

3、，不必造反性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒DNAo然而，較長(zhǎng)一代的載體（如pBR322）由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉索繼續(xù)培養(yǎng)若十小時(shí)，以便對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時(shí)內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像PBR322-類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉索處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物屮捉取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者人為增高。多年來，加入足以完全抑制蛋口質(zhì)合成的氯霉素（pg/ml）Q成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提収的質(zhì)粒DNA量，對(duì)于

4、分子克隆中兒乎所有想象到的工作任務(wù)。二、細(xì)菌的收獲和裂解細(xì)菌的收獲口J通過離心來進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則町以采川多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法収決于3個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出楮確的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。1、大質(zhì)粒（大于15kb）容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然

5、后川溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS-?類去污劑溶解球形體。這種方法最人限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需耍的作用力。2、可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，冇時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全大然的超螺旋分子。3、一些大腸桿菌菌株（如HB101的一

6、些變種衍生株）用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化錐一溟化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。故從諸如HB101和TG1等大腸桿菌菌株11?大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。4、當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酚A的大腸桿菌菌株（endA+株，如HB101）中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒芡耆珳缁顑?nèi)切核酸酶A,以后在溫育（如用限制酶消化）時(shí)，質(zhì)粒

7、DNA會(huì)被降解。但如果通過一個(gè)附加步驟（用酚：氯仿進(jìn)行抽捉）可以避免此問題。5、忖前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不盂要用氯霉索進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿川氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大雖制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)屮期在增減物屮加入氯霉索可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉索存在時(shí)從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素吋從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量人致相等。三、質(zhì)粒DNA的純化常使用的所有純化方

8、法都利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉合壞狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用氯化鈉一漠化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA就取決于漠化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。浪化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA屮引入超螺旋單位。最示，超螺旋度人為增加，從而阻止了漠化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分了不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和（每2個(gè)堿棊