質(zhì)粒DNA地提取、純化與鑒定

《質(zhì)粒DNA地提取、純化與鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案質(zhì)粒DNA的提取、純化與鑒定摘要：本實(shí)驗(yàn)利用堿變法從大腸桿菌DH5（E.coliDH5）中提取pUC19質(zhì)粒，旨在學(xué)習(xí)并掌握質(zhì)粒DNA提取的原理、純化和檢測(cè)方法及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。同時(shí)通過(guò)對(duì)質(zhì)粒DNA的提取、純化過(guò)程及電泳圖譜的分析，探討堿變法提取高質(zhì)量質(zhì)粒DNA的關(guān)鍵步驟及影響所提質(zhì)粒純度和量的相關(guān)因子。關(guān)鍵詞：堿變法質(zhì)粒電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行DNA的分離純化的實(shí)驗(yàn)原理。2.學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。3.學(xué)習(xí)并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。4.掌握堿變性提取發(fā)的原理及各種試劑的作用。5

2、.掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。實(shí)驗(yàn)原理：1.質(zhì)粒DNA的提取——堿變性提取法：提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡(jiǎn)單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測(cè)定及分析。EB-氯化銫密度梯度離心法，主要適合于相對(duì)分子質(zhì)量與染色體DNA相近的質(zhì)粒，具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定，且得到的質(zhì)粒DNA多為超螺旋構(gòu)型等優(yōu)點(diǎn)，但提取

3、成本高，需要超速離心設(shè)備。少量提取質(zhì)粒DNA還可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的質(zhì)粒DNA中常含有RNA，但不影響限制性核酸內(nèi)切酶的消化、亞克隆及連接反應(yīng)等。堿變性法提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來(lái)，但兩者變性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12.0的堿性溶液中，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性；共價(jià)閉合環(huán)

4、狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。當(dāng)用pH值4.6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清的質(zhì)粒DNA，可用無(wú)水乙醇和鹽溶液，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNa

5、seA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。2.凝膠電泳進(jìn)行DNA分離純化：文檔大全實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案電泳(electrophoresis)是帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場(chǎng)中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場(chǎng)中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小

6、不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)或SYBRGold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)

7、型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸(5—500bp)的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長(zhǎng)度上相差1bp或質(zhì)量上相差0.1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長(zhǎng)鏈狀多聚物，由β-D-吡喃半乳糖與3,6-脫水-L-吡喃半乳糖組成，相對(duì)分子質(zhì)量為104-105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其

8、凝固點(diǎn)為40-45℃。瓊脂糖凝膠相對(duì)于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大(50至百萬(wàn)bp)，小片段DNA(50-20000bp)最適合在恒定輕度和方向的電場(chǎng)中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測(cè)定DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶