11.20 分生實(shí)驗(yàn)報(bào)告 質(zhì)粒DNA的提取、純化與鑒定

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1、實(shí)驗(yàn)四質(zhì)粒DNA的提取，純化與鑒定DNA體外重組技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并篩選出能表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、擴(kuò)增，成為克隆。【實(shí)驗(yàn)步驟】1.分離或合成感興趣的目的基因及載體---分2.構(gòu)建、改造作為載體的DNA------------切3.目的基因與載體DNA在體外重組--------接4.重組DNA引入受體細(xì)胞----------------轉(zhuǎn)5.陽(yáng)性重組子的篩選、鑒定、擴(kuò)增-------篩【注意事項(xiàng)】目的基因的

2、獲得：1.從染色體DNA中直接分離2.人工合成3.由mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA4.從基因組文庫(kù)中篩選目的基因5.PCR獲得載體的選擇：1.能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，并能攜帶重組DNA片段一同擴(kuò)增；2.有合適的限制性酶切位點(diǎn)便于進(jìn)行克??；3.有一定的篩選標(biāo)記，易于識(shí)別和篩選；4.載體分子應(yīng)盡量小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制；5.表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；6.生物安全性好。質(zhì)粒DNA的提取【實(shí)驗(yàn)原理】質(zhì)粒是細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體之外的能自主復(fù)制的遺傳單位?；蚬こ讨械馁|(zhì)粒一般是指細(xì)菌質(zhì)粒，

3、它可以隨著細(xì)菌的細(xì)胞分裂將自己的遺傳特性穩(wěn)定的遺傳給后代細(xì)胞。質(zhì)粒中除了復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等相關(guān)的必需序列外，有一些DNA區(qū)段對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)并非必需序列，通過(guò)體外操作以目的基因取代這些非必需區(qū)段，這種改造的質(zhì)粒就成為外源基因載體。按照質(zhì)粒載體的用途和其外源DNA的遺傳信息能否表達(dá)可分為中間克隆載體（如pMD18-T）和表達(dá)載體（如pET-X、pBI121等）?？寺≥d體所連接的的DNA片段一般沒(méi)有啟動(dòng)子，因而不能轉(zhuǎn)錄，主要用于目的片段的大量制備。表達(dá)載體按照宿主的不同有各種各樣的原核表達(dá)載體（如大腸桿菌）和真核表達(dá)載體（如酵母、動(dòng)物和植物），目

4、的基因在載體上有完整的啟動(dòng)子和終止子調(diào)控，可以在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白。根據(jù)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中復(fù)制調(diào)控機(jī)制的不同，可分為兩類：一類是“松馳型”質(zhì)粒，如pMB1/colE1復(fù)制子，其復(fù)制受到一種稱為RNAII的分子正向調(diào)控，不需要任何質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)，完全依賴于宿主提供的壽命較長(zhǎng)的酶和蛋白質(zhì)，因此即使在氨基酸饑餓或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白質(zhì)合成的條件下，其復(fù)制仍不停止，；二是“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒，如pSC101，其復(fù)制伴隨著RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白質(zhì)合成受阻，其拷貝數(shù)就不能增加，即在宿主的“嚴(yán)緊”控制下復(fù)制。在分子生物學(xué)研究中，

5、為了迅速擴(kuò)增和提取大量的質(zhì)粒DNA，通常使用的是“松馳型”質(zhì)粒；但在某些特殊原因（如表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性）下要求用嚴(yán)緊型質(zhì)粒。構(gòu)型：超螺旋型SC---結(jié)構(gòu)致密跑得快電泳時(shí)最快。開環(huán)型OC---體積最大,不易從膠孔中穿過(guò)。線型LC---居中。堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的原理：基于質(zhì)粒DNA與染色體DNA變性與復(fù)性的差異。即利用SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ三種溶液分離提取質(zhì)粒DNA，在PH=12.6時(shí)，染色體DNA完全變性，質(zhì)粒DNA變性不完全；在PH=4.8時(shí)，質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體DNA不能復(fù)性。約67%體積分?jǐn)?shù)的無(wú)水乙醇中，質(zhì)粒DNA沉

6、淀。70%的乙醇起洗滌作用?！咀⒁馐马?xiàng)】1、質(zhì)粒DNA提取過(guò)程中動(dòng)作要輕柔，以免對(duì)DNA造成損傷2、加SolutionⅠ后一定充分打散懸浮菌體3、加入SolutionⅡ后放置時(shí)間不要超過(guò)5min，以免變性質(zhì)粒不易復(fù)性4、加入SolutionⅢ后液體應(yīng)由渾濁變?yōu)橥该髡吵?，可見拉絲現(xiàn)象。若沒(méi)有上述現(xiàn)象發(fā)生，則實(shí)驗(yàn)不能繼續(xù)下去，應(yīng)檢查試劑配制及操作是否有誤，然后重新開始5、提取質(zhì)粒后應(yīng)盡量扣干，因?yàn)闅埩舻囊掖伎赡苡绊懞罄m(xù)實(shí)驗(yàn)6、注意溫和震蕩和劇烈震蕩的區(qū)別電泳技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，稱為電泳。

7、帶有電荷的生物分子在電場(chǎng)作用下可發(fā)生移動(dòng)。由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量以及分子量各不相同，在同一電場(chǎng)作用下，各組分的泳動(dòng)方向和速度也各有差異，所以在一定時(shí)間內(nèi)，它們移動(dòng)距離不同，從而可達(dá)到分離鑒定的目的。在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。常用的是瓊脂糖凝膠電泳一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：1

8、.雙重效應(yīng)：電泳效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。2.操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品無(wú)需預(yù)處理。3.電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。4.凝膠透明且無(wú)紫外吸收，可在紫外燈下觀看結(jié)果。5.易染色，易洗脫，便于定量。核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：（1）