質(zhì)粒dna提取與純化

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1、....頁眉質(zhì)粒DNA的提取與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的原理和各種試劑的作用及方法。2學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳法進(jìn)行DNA的分離純化的實(shí)驗(yàn)原理及方法。3學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。實(shí)驗(yàn)原理：簡明原理：堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA，而染色體DNA不會(huì)復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去。提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB一氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為

2、經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶序列測定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。....頁腳.....頁眉在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在PH高達(dá)12.0的堿性溶液中，染色體DNA煩人氫鍵斷裂雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，共價(jià)閉環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷

3、裂而變性，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分開。當(dāng)用PH為4.6的KAc高鹽溶液調(diào)節(jié)PH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可發(fā)生復(fù)性恢復(fù)共價(jià)閉環(huán)的超螺旋結(jié)構(gòu)而溶于溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性，與不穩(wěn)定大分子纏連在一起形成沉淀，通過離心與溶于溶液中的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液中的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液使之凝聚成沉淀。由于RNA與DNA性質(zhì)相似，乙醇沉淀DNA時(shí)也伴隨著RNA的沉淀，可用RNA酶降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNase以及一些可溶蛋白可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)速度可因

4、電離子的大小，形態(tài)，電荷量的不同而有所差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因此可用凝膠電泳法分離，鑒定和純化DNA片段。凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（EB）染色直接觀察到，甚至含量少至20Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。....頁腳.....頁眉瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進(jìn)一步純化DNA等。瓊脂糖凝膠

5、電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面6個(gè)因素：（1）樣品DNA分子的大?。?）緩沖液,（3）溫度（4）DNA分子的構(gòu)象：一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。（5）瓊脂糖濃度：通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越低。（6）電泳所用電場：凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強(qiáng)度應(yīng)小于5V／cm。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)儀器與

6、材料：恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩器，水浴鍋，1.5ml離心管，50ml離心管，不同型號(hào)的吸頭，微量移液器，微波爐，電泳儀，制膠槽，梳子，錐形瓶，離心機(jī)。菌體：E.coliDH5a受體菌，具有Ampr標(biāo)記的質(zhì)粒DNApUC19.實(shí)驗(yàn)試劑及其理化作用：LB培養(yǎng)液，抗生素溶液Ⅰ（50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0）：葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA....頁腳.....頁眉是陽離子螯合劑，抑制DNase的活性。溶液Ⅱ（0.2MNaOH/1%SDS）：使細(xì)胞破裂，使質(zhì)粒

7、DNA與染色體DNA同時(shí)變性。溶液Ⅲ（3M醋酸鉀/2M醋酸）：這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時(shí)基因組DNA也被PDS共沉淀。加醋酸中和使溶液呈中性，使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，但不能使染色體DNA復(fù)性。RNase酶母液，TE緩沖液（10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)），飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）：氯仿可使蛋

8、白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。遇冷無水乙醇，70%乙醇，TAE電泳