成年大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)衰老細(xì)胞的鑒定

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1、成年大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)衰老細(xì)胞的鑒定成年大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)衰老細(xì)胞的鑒定摘要：目的：鑒定不同年齡大鼠培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的衰老細(xì)胞鑒定。方法：取6月齡和18月齡雄性SD大鼠海馬進(jìn)行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6d、10d和14d利用衰老相關(guān)的B半乳糖首酶(SenesceneeassociatedP-galactosidase,SA-B-GAL)進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果：18月齡培養(yǎng)10d和14d的海馬神經(jīng)元SA-B-GAL染色較6月齡培養(yǎng)6d的海馬神經(jīng)元明顯增多(?p?V0.001)。結(jié)論：老年大鼠海馬神經(jīng)

2、元體外培養(yǎng)進(jìn)入衰老狀態(tài)的時(shí)間較青年大鼠早。?關(guān)鍵詞：海馬神經(jīng)元；衰老；衰老相關(guān)的B半乳糖營(yíng)酶?中圖分類(lèi)號(hào):R339.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1673-2197(2008)07-009-02??衰老相關(guān)的B半乳糖昔酶(SenescenceassociatedP-galactosidase,SA-B-GAL)是目前被廣泛采用的一種生物學(xué)標(biāo)記物，它在衰老細(xì)胞中表達(dá)升高，因此成為鑒定細(xì)胞衰老的一個(gè)標(biāo)志[1,2]o值得提出的是，有些衰老的生物學(xué)標(biāo)記并不具有普遍性，SA-B-GAL作為一個(gè)衰老的生物學(xué)標(biāo)記在體外

3、檢測(cè)復(fù)制衰老的細(xì)胞已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可[3],但其是否能夠用于檢測(cè)衰老神經(jīng)元，目前尚未得到證實(shí)，因此在應(yīng)用上應(yīng)加以驗(yàn)證。目前對(duì)衰老細(xì)胞的研究,衰老細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞變大，變扁平[4],然而在除此以外還有端粒變短，細(xì)胞周期停滯等特征，而鑒丁神經(jīng)元屬于靜止細(xì)胞,因此在衰老細(xì)胞鑒定生物學(xué)標(biāo)記的選擇時(shí)具有特異性，本研究擬對(duì)培養(yǎng)不同天數(shù)的海馬神經(jīng)元進(jìn)行SA-13-GAL染色，從而鑒定衰老的海馬神經(jīng)元，同時(shí)驗(yàn)證SA-3-GAL在海馬神經(jīng)元應(yīng)用的可靠性。?1材料與方法?1.1海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)?分別取6月齡及

4、18月齡雄性SD大鼠各2?3只，進(jìn)行海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)。取海馬組織：全身75%酒精消毒，斷頭取腦，將整個(gè)腦組織置于冷的HBSS（無(wú)Ca2+Mg2+）平衡液屮,利用彎頭玻璃棒將兩側(cè)海馬完整取出。HBSS液洗4次，去除混雜的血管和血液。胰酶消化：用剪刀將海馬組織剪成lmm3的小塊，用HBSS洗4次，0.25%的胰酶37°C消化15mino終止消化：加入終濃度為10%的胎牛血清孵育5min終止消化，隨后用IIBSS洗4?5次去除殘留的胎牛血清。吹打細(xì)胞：在15mL離心管中加入5mLNeurobasalA用P

5、asteur管吹打組織碎塊,將渾濁的上清液收集到另一個(gè)15mL離心管中,200g離心lOmin,棄上清。接種細(xì)胞：沉淀用NeurobasalA液加B27重懸，在24孔板中接種在lOOmg/mLpoly-L-lysine處理過(guò)的蓋玻片上，密度約5^8X105cells/mL,在37°C,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)第五天加入lOmmoL阿糖胞甘抑制膠質(zhì)細(xì)胞和纖維母細(xì)胞&長(zhǎng)，從接種第六天起可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。?1.2SA-3-GAL的細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)?分別取細(xì)胞接種后第6d、10d和14d的培養(yǎng)神經(jīng)元在4%的多聚甲

6、醛中室溫固定15min,-20°C保存。接種細(xì)胞的蓋玻片在室溫下放置約30min,用X-Gal洗液（lOOmM磷酸鈉;2mMMgC12；0.01%脫氧膽酸鈉）洗三次，每次15min,用X-Gal染液（lOOmM磷酸鈉,2mMMgC12,150mM氯化鈉,0.01%脫氧膽酸鈉，0.02%NP-40,5mM鐵氧化鉀，5mM亞鐵氤化鉀,lmg/mLX-gal）在37°C避光16~18h,PBS清洗3次，0.1%核固紅室溫復(fù)染20mino晾干后中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀(guān)察，拍片，計(jì)數(shù)。?2結(jié)果?SA-B-GAL陽(yáng)

7、性率均隨著培養(yǎng)吋間延長(zhǎng)而增加，在培養(yǎng)6d的神經(jīng)元SA-B-GAL陽(yáng)性表達(dá)較少，而在10d和14d的神經(jīng)元中表達(dá)明顯增加（?p?V0.001）,同吋培養(yǎng)10d的18月齡組比6月齡組陽(yáng)性率明顯增加（?P?＜0.05）,然而在培養(yǎng)14d吋兩組陽(yáng)性率差別不明顯,表1所示。?3討論?本研究結(jié)果提示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，成年海馬神經(jīng)元中的衰老神經(jīng)元明顯增加，與新生大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)相比，成年大鼠神經(jīng)元存活時(shí)間較短，出現(xiàn)SA-B-GAL陽(yáng)性染色的吋間較早(未發(fā)表)。在木研究中發(fā)現(xiàn)老年大鼠在海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)中，出

8、現(xiàn)SA-B-GAL標(biāo)記的衰老細(xì)胞較青年大鼠早，然而在延長(zhǎng)培養(yǎng)后期，衰老細(xì)胞已趨向于飽和，而此吋差別并不明顯。SA-B-GAL是目前比較普遍應(yīng)用的衰老牛物學(xué)標(biāo)記物[1],多數(shù)的研究應(yīng)用于復(fù)制衰老，而復(fù)制衰老是指真核細(xì)胞在完成有限分裂次數(shù)后，喪失合成DNA的能力,導(dǎo)致增殖能力喪失而僅維持細(xì)胞基木的代謝能力的狀態(tài)，比較經(jīng)典的復(fù)制衰老的細(xì)胞模型是人二倍體細(xì)胞(humandiploidfibroblasts,HDFs)[2,5]o然而，神經(jīng)元屬于靜止細(xì)胞，在體外培