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1、原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)溶液的配制：(1)4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100mlpH=7.4的0.01mol/lPBS中，混勻過濾，室溫保存。(2)磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.01mol×l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4×12H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，雙蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2mm濾膜過濾，4℃保存。(3)1%蛋白酶的配制：用磷酸緩沖液（pH=7.2～7.4）配制成濃度為1%的胰蛋白酶母液凍存。使用時(shí)，用解剖液稀釋至0.25%。(4)培養(yǎng)皿涂被多聚賴
2、氨酸：配制0.01%的多聚賴氨酸，分裝凍存。將上述多聚賴氨酸放入培養(yǎng)皿中涂?jī)杀?，自然晾干后備用?5)解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04×7H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加雙蒸水1000ml，調(diào)pH=7.0～7.4，過濾，4℃保存。(6)種植液：DMEM79%，胎牛血清，10%；馬血清，10%；谷氨酰胺培養(yǎng)液1%。(7)飼養(yǎng)液：Neurobasal培養(yǎng)基，97%；谷氨酰胺培養(yǎng)液，1%；B-27，2%。(8)阿糖胞苷：用雙蒸水配
3、制成濃度為lmg×ml-1的母液儲(chǔ)存。用0.2mm濾膜過濾，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)，取6ml母液加入2ml培養(yǎng)液中，終濃度為3mg×ml-1。（根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整濃度）大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)(1)新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后斷頭，剝離出全腦并將其放入盛有解剖液的培養(yǎng)皿中。(2)在解剖液中解剖大腦，分離出海馬，移入另一盛有解剖液的培養(yǎng)皿中。在分離出全部的海馬后，去除血管等組織，然后用剪刀將海馬分成數(shù)小塊，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入9%CO2、37℃消化20min。(3)將培養(yǎng)皿中的海
4、馬碎片移入離心管中，去除含胰蛋白酶的液體并用種植液將海馬碎片沖洗2～3遍，終止酶的消化作用。(4)在離心管中加入2ml的種植液，用口徑遞減的吹打管輕輕吹打海馬碎片數(shù)次，將上清液吸出備用，再加入2ml的種植液后，用吸管吹打數(shù)次，將上清液吸出備用，如此反復(fù)數(shù)次，至海馬碎片全部被吹打散開。（每次吹打10次，吹打時(shí)注意不要吹入空氣，吹打盡量輕柔）(5)吸出的上清液再加入種植液調(diào)整其濃度，用200目細(xì)胞篩過濾。(6)將上述濾過的液體混勻后分裝入已涂有0.1mg×ml-1多聚賴氨酸的96孔板上，使分散的細(xì)胞計(jì)數(shù)約為0.3x106×ml-
5、1。然后將96孔板放入9%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(7)12h后觀察細(xì)胞，鏡下可見多數(shù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。生理鹽水沖洗細(xì)胞2遍以上以去除細(xì)胞碎片然后換上已平衡好的飼養(yǎng)液。(8)培養(yǎng)36h后加入阿糖胞苷3mg×ml-1以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)。(9)加入阿糖胞苷后12h換液。以后每3d半量換液，飼養(yǎng)至7～14d可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(10)或種板40min后，更換飼養(yǎng)液。種板后12h，更換飼養(yǎng)液。然后每3天半量換液。注：第一種方法細(xì)胞純度高，但對(duì)細(xì)胞損害較大，需要較高培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)的細(xì)胞適用于MTT等實(shí)驗(yàn)。第二種方法細(xì)胞純度較高，對(duì)
6、細(xì)胞損害較小，細(xì)胞狀態(tài)好。培養(yǎng)的細(xì)胞適用于膜片鉗
