化學(xué) 鹽析沉淀法.ppt

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1、一、鹽析沉淀法鹽析法：在高濃度中性鹽存在下，欲分離物質(zhì)在中性鹽水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀。早在19世紀(jì)鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，目前該方法仍廣泛用來(lái)回收或分離蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)。（一）基本原理蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周?chē)h(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可利用度。這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵和蛋白質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度等參數(shù)的影響。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，表面：大部分是親水基團(tuán)內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán)蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散

2、狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周?chē)乃肿佑行蚺帕?，在表面形成水化膜，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時(shí)：低鹽--鹽溶(低鹽情況下，隨著中性鹽離子強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大)高鹽--鹽析(高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小)鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化作用從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域H+OH-+++++++++++pH

3、_______pH>pI,帶負(fù)電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_+++++____pH=pI時(shí),有水膜，是不穩(wěn)定的親水膠體中性鹽破壞水膜+++++++++++中性鹽破壞水膜_+++++____中性鹽破壞水膜_________中性鹽中和電荷SO42-中性鹽中和電荷NH4+或Na+蛋白質(zhì)的鹽析機(jī)制示意圖蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價(jià)離子影響更顯著。通常用離子強(qiáng)度表示對(duì)鹽析的影響。1234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5碳氧血紅蛋白的lgS與(

4、NH4)2SO4離子強(qiáng)度μ的關(guān)系S0βμ(離子強(qiáng)度)lgS鹽析鹽溶鹽析區(qū):lgS=β-Ksμ蛋白質(zhì)溶解度常數(shù)鹽析常數(shù)鹽離子強(qiáng)度蛋白質(zhì)溶解度起始蛋白濃度（二）無(wú)機(jī)鹽的選擇在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有(NH4)2SO4,Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4,K3PO4。(NH4)2SO4原因廉價(jià)在水中溶解度大，且溶解度隨溫度變化小，低溫下仍具有較大的溶解度對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的活力無(wú)損害020406080100中性鹽溫度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.675.4

5、81.088.095.31034.918.948.345.343.342.2--34.544.454.663.670.81.67.854.182.693.8101常用鹽析劑在水中的溶解度（g/100ml水）鹽析效果：陰離子>陽(yáng)離子尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。常見(jiàn)陰離子的鹽析作用順序：PO43->SO42->CH3COO>Cl>NO3>ClO4>I>SCN陽(yáng)離子對(duì)鹽析效果的影響：Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+無(wú)機(jī)鹽可按兩種方式加入溶液中：直接加入固體(NH4)

6、2SO4粉末—工業(yè)生產(chǎn)(分批加入，充分?jǐn)嚢?加入(NH4)2SO4飽和溶液—實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)(防止溶液局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)溶液會(huì)被稀釋)（三）影響鹽析的各種因素?zé)o機(jī)鹽的加入量蛋白質(zhì)的濃度溫度pH操作方式1.無(wú)機(jī)鹽加入量的影響1234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5S0βμ(離子強(qiáng)度)lgS鹽析蛋白質(zhì)溶解度0246810-0.500.50-1.00μ(離子強(qiáng)度)lgS蛋白質(zhì)溶解度0不同蛋白質(zhì)溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系蛋白質(zhì)種類(lèi)不同，鹽析所用的無(wú)機(jī)鹽量也不同對(duì)于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生

7、沉淀時(shí)的無(wú)機(jī)鹽濃度范圍都是一定的，即具有一定的蛋白質(zhì)鹽析分布曲線(xiàn)。30lgS蛋白質(zhì)溶解度2030405060702040100P—不同(NH4)2SO4飽和度C0蛋白質(zhì)沉淀的速度可用-—對(duì)鹽飽和度（P）作圖來(lái)表示：dSdP62030405060704820dSdP–—蛋白質(zhì)溶解度隨(NH4)2SO4飽和度而變化的速率P利用不同蛋白質(zhì)鹽析分布曲線(xiàn)在橫軸上的位置不同，可采取先后加入不同量無(wú)機(jī)鹽的辦法來(lái)分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)。2.蛋白質(zhì)濃度的影響蛋白質(zhì)濃度不同，沉淀所需無(wú)機(jī)鹽用量也不同。隨濃度提高，鹽用量減少。6405060708

8、04820dSdP–—P不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線(xiàn)3g/L30g/L分級(jí)沉淀：將溶液稀釋?zhuān)怪丿B曲線(xiàn)拉開(kāi)距離制取成品：提高蛋白質(zhì)濃度3.溫度的影響低鹽濃度：溫度升高，溶解度升高高鹽濃度：溫度升高，溶解度降低溫度適當(dāng)提高有利于蛋白質(zhì)沉淀。高溫容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)鹽析一般在室溫下進(jìn)行，某些溫度敏感性的蛋白質(zhì)鹽析最好在低溫下進(jìn)行。4.p