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《丙酮丁醇梭菌遺傳操作系統(tǒng)的改造》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、分類號密級UDC編號中國科學(xué)院研究生院博士學(xué)位論文丙酮丁醇梭菌遺傳操作系統(tǒng)的改造董紅軍指導(dǎo)教師李寅研究員中國科學(xué)院微生物研究所申請學(xué)位級別博士學(xué)科專業(yè)名稱微生物學(xué)論文提交日期論文答辯日期培養(yǎng)單位中國科學(xué)院微生物研究所學(xué)位授予單位中國科學(xué)院研究生院答辯委員會主席ADissertationSubmittedtotheCommitteeofInstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciencesforPh.D.DegreeImprovementofGeneticManipulationSystemfor
2、ClostridiumacetobutylicumByHongjunDongDirectedbyProf.YinLiMay2011,Beijing摘要摘要丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)是一種工業(yè)上用于生產(chǎn)溶劑(包括丙酮、丁醇、乙醇)的細菌。由于丁醇是一種潛在的可替代汽油的生物燃料，丙酮丁醇梭菌近年來引起了廣泛的關(guān)注。對丙酮丁醇梭菌的遺傳學(xué)研究及菌株改造是實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化的一個基礎(chǔ)工作，但是由于丙酮丁醇梭菌是嚴格厭氧的革蘭氏陽性細菌，雖然目前已經(jīng)發(fā)展出一些遺傳操作方法，但是仍存在著不少問題，限制了遺傳操作的
3、效率。本論文就目前丙酮丁醇梭菌遺傳操作過程中所遇到的一些基本問題進行了研究，主要包括：1)解除丙酮丁醇梭菌中的限制修飾系統(tǒng)。丙酮丁醇梭菌細胞內(nèi)存在著嚴格的限制修飾系統(tǒng)，可以降解外源DNA，目前的解決方法是對要進行轉(zhuǎn)化的DNA進行甲基化修飾(使用來自芽胞桿菌噬菌體Ф3TI甲基化酶)。本論文選定可能編碼二型限制性內(nèi)切酶Cac824I的基因CAC1502為靶點，通過二型內(nèi)含子基因敲除技術(shù)對其進行了失活，得到了突變體菌株SMB009，使用該菌株進行轉(zhuǎn)化時，使用的DNA無需預(yù)先進行DNA甲基化修飾即可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。2)實現(xiàn)丙酮丁醇梭菌的有氧轉(zhuǎn)化。因為
4、丙酮丁醇梭菌對氧氣敏感，所以對其進行操作的過程需要在厭氧條件下(厭氧箱)進行。為了能夠使丙酮丁醇梭菌在空氣中進行操作，我們以SMB009為出發(fā)菌株，失活了其中的氧氣響應(yīng)負調(diào)控蛋白編碼基因CAC2634，得到的突變體菌株SMB012可以實現(xiàn)在空氣中進行轉(zhuǎn)化操作，使得整個操作過程可以不依賴于厭氧箱，且節(jié)約時間近40%。3)發(fā)展了適用于丙酮丁醇梭菌的誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)。我們以氯霉素抗性基因cat的啟動子為模型，通過引入不同組合的四環(huán)霉素抗性基因操縱子調(diào)控序列tetO，發(fā)展出了pGusA2-2tetO1和pGusA2-tetO2/1兩個系統(tǒng)，經(jīng)10
5、0ng/ml脫水四環(huán)霉素(aTc)誘導(dǎo)3小時后，報告基因表達的β-葡萄糖苷酸酶(GusA)誘導(dǎo)倍數(shù)分別是120倍和149倍。I丙酮丁醇梭菌遺傳操作系統(tǒng)的改造本論文通過基因工程手段提升了丙酮丁醇梭菌的遺傳可操作性，提供了可接受非甲基化DNA并且可在空氣中進行轉(zhuǎn)化的丙酮丁醇梭菌工程菌株，以及適用于丙酮丁醇梭菌的誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)。這些工作的開展為把丙酮丁醇梭菌改造成為實驗室中易于操作的模式生物奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：丙酮丁醇梭菌、遺傳操作、限制修飾系統(tǒng)、有氧轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)IIAbstractAbstractClostridiumacetobu
6、tylicumisknownastheproducerofsolvents(acetone,butanolandethanol).Becauseoftheexcellentcharacteristicsofbutanolasbiofuel,manyattentionswerepaidontheresearchofC.acetobutylicum.Tomaketheproductionprocesseconomicallyfeasible,strainimprovementisanessentialstep.However,C.aceto
7、butylicumisdifficulttomanipulatebecauseitisanaerobicandGram-positive.Inthisdissertation,thesubjectistosolvesomeproblemsinthegeneticmanipulationprocess.Thecontentmainlycontainsthreeparts:1)ReleaseoftheRestriction-Modificationsystem(RMsystem)inC.acetobutylicum.Typically,th
8、eDNA,whichwillbeintroducedintoC.acetobutylicum,needstobemethylatedbyФ3TImethyltransferasefromthephageФ3
